Test mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania mitofagii u drożdży Saccharomyces cerevisiae

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest śledzenie wchłaniania mitochondriów do VAE w celu zbadania autofagii mitochondriów, procesu znanego jako mitofagia. Osiąga się to poprzez ekspresję w komórkach drożdży, genetycznie kodowanego i ukierunkowanego na mitochondria fluorescencji o podwójnej emisji, biosensora pH o nazwie Mt Rosea, który znakuje mitochondria czerwoną i zieloną fluorescencją. W drugim etapie komórki drożdży są poddawane głodowi azotu w celu wywołania autofagii.

Następnie oglądamy komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej w celu uwidocznienia wychwytu mitochondriów do va. Uzyskano wyniki, które wskazują na akumulację czerwonej, ale nie zielonej fluorescencji w VA komórek pozbawionych azotu. Wskazanie punktacji autofagii komórek w populacji pozwala na określenie stopnia mitofagii.

Wykorzystanie rosea do monitorowania wychwytu mitochondriów do wakuoli komórek drożdży może dostarczyć mechanistycznego wglądu w proces mii. Podejście to można dostosować do monitorowania autofagii innych przedziałów komórkowych, takich jak jądro, które demonstruje procedurę, będzie Dalibor alica, badacz z tytułem doktora z naszego laboratorium. W tym protokole używamy szczepu typu dzikiego BY 4, 7, 41 i zmutowanego szczepu deltacyjnego delta A TG trzy, pochodzącego z tego samego tła genetycznego, aby zwizualizować lokalizację mitochondriów.

W tych szczepach są one oznaczone fluorescencyjnym reporterem. Rosea Rosea to dwukolorowy bioczujnik emisyjny, składający się ze stosunkowo stabilnego pH białka czerwonej fluorescencji i wrażliwego na pH białka zielonej fluorescencji. Mitochondrialna sekwencja docelowa służy do kierowania biosensora Rosea do macierzy mitochondrialnej.

Ten reporter został nazwany Mt.Rosea, przy wysokim pH biosensor fluoryzuje zarówno na czerwono, jak i na zielono. Jednak przy niskim pH fluoryzuje tylko na czerwono. Szczep typu dzikiego jest szczepem kontrolnym wskazującym poziomy autofagii normalnie oczekiwane jako kontrola negatywna.

Odpowiedni jest szczep zerowy dla ekspresji niezbędnego genu autofagii. Ponieważ taki szczep nie może dostarczyć mitochondriów do wakuoli, stosuje się standardowe procedury do przekształcania szczepów drożdży z plazmidem przenoszącym mitochondrialne docelowe płytki wzrostu rozali reporterowej inkubuje się przez dwa do czterech dni w temperaturze od 28 do 30 stopni Celsjusza, aż do pojawienia się kolonii o średnicy około dwóch do trzech milimetrów w celu wyhodowania komórek do indukcji autofagii, Zaszczepić dla każdego szczepu pojedynczą kolonię drożdży w 10 mililitrach wzrostu. Pożywka zawierająca niefermentujące źródło węgla.

W takim przypadku etanol i odpowiednie suplementy zanikowe wołów. Dla każdej odmiany hodowane są zduplikowane kultury, co daje w sumie cztery kultury. Inkubować kultury drożdży przez około 48 godzin w temperaturze od 28 do 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem orbitalnym, do tego czasu kultury powinny znajdować się w środkowej fazie wzrostu.

Pod koniec okresu inkubacji przenieś dwie jednomililitrowe próbki każdej kultury do 1,7 mililitra. Plastikowe probówki wirówkowe z zatrzaskiem delikatnie granulują komórki przez wirowanie z niską prędkością. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant z każdej probówki, nie naruszając osadu komórkowego.

Przemyć komórki jednym mililitrem sterylnej wody destylowanej przez ponowne wymieszanie, a następnie odwirowanie. Powtórz pranie jeszcze dwa razy, aby usunąć resztki pożywki. Po trzecim płukaniu ponownie zawieś komórki w 100 mikrolitrach wzrostu, pożywce lub głodzie azotu.

Pożywka z niedoborem azotu zawiera etanol będący źródłem węgla, ale brakuje w nim suplementów azotu i indukuje autofagię w komórkach. Następnie ponownie zaszczepij zawieszone komórki w 10 mililitrach świeżego wzrostu. Średni lub 10 mililitrów głodu azotu. Średni.

Inkubuj kultury z wytrząsaniem orbitalnym przez sześć do 12 godzin po indukcji autofagii. Przydatne jest potwierdzenie dostarczenia Mt Rosea do vae pod mikroskopem fluorescencyjnym. Vae można zlokalizować, etykietując za pomocą niebieskiego barwnika fluorescencyjnego na bazie kumeryny, takiego jak siedem aminokwasów czterech chlorometylakumeryny, w skrócie L arginina mi cmac arg.

Etykietowanie za pomocą cmac ARG nie musi być wykonywane rutynowo, ale jest zalecane dla tych, którzy nie są zaznajomieni z lokalizacją i wyglądem wakuoli w drożdżach. Aby rozpocząć procedurę znakowania wakuoli, przenieś jedną mililitrową próbkę każdej kultury do oddzielnych 1,7 mililitra plastikowych probówek wirówkowych z zatrzaskową nasadką. Następnie dodaj cmac arg do każdej probówki.

Inkubować probówki w temperaturze od 28 do 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem orbitalnym przez 30 minut. Po 30 minutach osadzać komórki przez odwirowanie, wyrzucić supernatant, przemyć komórki jednym mililitrem sterylnej wody destylowanej za pomocą zawiesiny, a następnie odwirować. Umyj komórki jeszcze dwa razy sterylną wodą destylowaną.

Ten krok usuwa resztki pożywki i nadmiar matrycy cmac arg. Po trzecim płukaniu resus zawiesić komórki w 100 mikrolitrach sterylnej wody destylowanej. Komórki są teraz gotowe do zamontowania do obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Podczas wykonywania tego protokołu bardzo ważne jest, aby używać świeżo przekształconych kultur drożdży, aby zapewnić uzyskanie limfocytów T z wysoce fluorescencyjnymi mitochondriami. Aby przygotować żywe komórki drożdży do obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, najpierw stopić dwa miligramy aeros o niskiej temperaturze topnienia w oddzielnych mililitrowych podwielokrotnościach pożywki wzrostowej i pożywki do głodzenia azotu przez inkubację w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez jedną godzinę, stopiony aros utrzymuje się w temperaturze 70 stopni Celsjusza. Aby zamontować komórki, umieść 20 mikrolitrów stopionego aros na oznaczonym szklanym mikroskopie o wymiarach 76 na 26 milimetrów.

Natychmiast wsunąć 10 mikrolitrów przemytej zawiesiny komórkowej na złoże arosowe. Przykryj łóżko aros szklanym szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 22 na 22 milimetry. Komórki rozprzestrzenią się po powierzchni agros pod szkiełkiem nakrywkowym.

Następnie ostrożnie uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego cienką warstwą lakieru do paznokci. Zapobiegnie to odwodnieniu i przesuwaniu się szkiełka nakrywkowego Podczas obrazowania, gdy lakier do paznokci jest całkowicie suchy, szkiełka są gotowe do oglądania przez zamontowane komórki mikroskopii fluorescencyjnej. Zastosowanie tej techniki można obserwować do jednej godziny po zamontowaniu bez żadnych widocznych negatywnych skutków dla komórek.

Ponieważ komórki drożdży są stosunkowo małe, potrzebny będzie dobrej jakości mikroskop fluorescencyjny wyposażony w filtry emisji wzbudzenia odpowiednie do oddzielnej wizualizacji emisji GFP i emisji RFP oraz soczewkę obiektywową zanurzoną w wodzie 60 x z aperturą numeryczną 1,2. Typowe wyniki uzyskane przy użyciu MT Rosea wyrażanej w komórkach typu dzikiego oraz przy użyciu konfokalnego skaningu laserowego. Mikroskopia jest pokazana tutaj w warunkach bez głodu z etanolem jako źródłem węgla, podczas gdy komórki typu wykazują typowy komórkowy rozkład mitochondriów na obrzeżach komórek drożdży, które wykazują zarówno czerwoną, jak i zieloną fluorescencję.

Emisja czerwonej i zielonej fluorescencji nie jest wykrywana w wakuoli. Gdy MT. Komórki typu dzikiego z ekspresją rosea są poddawane głodowi azotu przez sześć godzin i dłużej. Wykazują one oprócz czerwonej i zielonej fluorescencji odpowiadającej mitochondriom nagromadzenie czerwonej, ale nie zielonej fluorescencji w va.

Ten sygnał uliczny wskazuje na autofagię. Autofagiczny wychwyt mitochondriów ularnych. Lokalizacja rosea może być oddzielnie potwierdzona za pomocą CMAC arg.

W przeciwieństwie do tego, komórki kontroli ujemnej mitofagii wyrażające MT. Rosea obserwowana przed głodówką i po sześciu godzinach i później nie wykazuje akumulacji czerwonej fluorescencji w wakuoli. Podczas gdy znakowanie mitochondriów pozostaje silne w celu oceny poziomu autofagii w trzech zmutowanych szczepach typu dzikiego i A TG, zaobserwowano ponad 200 komórek na szczep pod kątem akumulacji czerwonej fluorescencji w ole przed indukcją autofagii i w wybranych punktach czasowych Po indukcji autofagii wykreślenie proporcji komórek wykazujących akumulację ularyczną ujawnia, że stopień wychwytu ularnego wzrasta z czasem w komórkach typu dzikiego, ale nie w delta ATG trzy zmutowane komórki, które nie mogą dostarczyć mitochondriów do wakuoli Po jego rozwoju. Technika ta umożliwiła naukowcom zajmującym się autofagią zbadanie dostarczania mitochondriów i innych organelli, takich jak jądro, do VA oraz różnych warunków wzrostu w tych komórkach.