Name: Test mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania mitofagii u drożdży Saccharomyces cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Poznaj metodę mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania mitofagii u drożdży Saccharomyces cerevisiae za pomocą biosensora Mt Rosea. Technika ta umożliwia wizualizację degradacji mitochondriów w wakuoli.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca została sfinansowana z grantu Australian Research Council DP0986937.

Wybór odpowiednich kontrolnych szczepów drożdży
Analiza opiera się na wizualnej ocenie akumulacji czerwonej fluorescencji w wakuoli drożdży. W związku z tym test jest subiektywny i zależy od wyboru odpowiednich szczepów kontrolnych oraz warunków hodowli. Kontrola typu dzikiego jest stosowana w celu określenia poziomów autofagii spodziewanych w warunkach normalnych. Jako kontrolę negatywną odpowiedni jest szczep z delecją jednego z kluczowych genów autofagii (np. ATG3); takie szczepy nie są w stanie dostarczyć materiału (np. mitochondriów, jądra komórkowego) do wakuoli
1. Transformacja komórek drożdży plazmidowym DNA
Komórki drożdży można łatwo uczynić kompetentnymi do transformacji poprzez traktowanie ich octanem litu (LiAcetate). Można zakupić gotowe zestawy komercyjne (np. EasyComp, Invitrogen), a dostępne są również opublikowane protokoły13.
W niniejszym protokole wykorzystujemy szczep typu dzikiego BY4741 (MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) oraz niektóre szczepy z kompleksowej biblioteki mutantów z delecjami (np. Δatg3) pochodzące od powyższego szczepu, z których każdy charakteryzuje się brakiem ekspresji innego genu nieessentialnego. Biblioteka szczepów z delecjami stanowi cenne narzędzie do badania autofagii z wykorzystaniem sond opartych na Rosella. 
Raportem zastosowanym w tym protokole jest mt-Rosella dla mitochondriów (Rys. 2A), kodowany przez pAS1NB:mt-Rosella12.
Poniższe kroki opierają się na wykorzystaniu komórek uczynionych kompetentnymi przy użyciu zestawu do transformacji EasyComp i przechowywanych w zamrożeniu w temperaturze -80°C w celu wygodnego użytkowania.
<ol>
	<li>30 minut przed dodaniem do komórek drożdży doprowadzić Roztwór III (EasyComp Transformation Kit) do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Do sterylnej plastikowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 ml dodać 2-2,5 μl (~100 ng/μl) plazmidowego DNA kodującego reporter (pAS1NB:mt-Rosella).</li>
	<li>Dodać 5 μl świeżo rozmrożonej zawiesiny kompetentnych komórek drożdży i wymieszać poprzez delikatne pipetowanie.</li>
	<li>Dodać 50 μl Roztworu III (EasyComp Transformation Kit) i wymieszać w wstrząsarku vorteksowym. Inkubować reakcje transformacji przez 1 godzinę w temperaturze 28-30°C, intensywnie mieszając co 15 minut za pomocą vorteksu lub ręcznie, delikatnie uderzając palcem w probówkę.</li>
	<li>Ostrożnie przenieść mieszaninę transformacyjną na jedną płytkę z agarem YMM uzupełnionym o histydynę, metioninę i uracyl, a następnie delikatnie rozprowadzić komórki po powierzchni agaru za pomocą sterylnego szklanego rozpylacza. Komórki drożdży są na tym etapie delikatne, a ostrożne obchodzenie się z nimi może zwiększyć wydajność transformantów.</li>
	<li>Inkubować płytki wzrostowe od 2 do 4 dni w temperaturze 28-30°C lub do momentu pojawienia się kolonii o średnicy około 2-3 mm.</li>
</ol>
2. Potwierdzenie ekspresji Rosella w komórkach drożdży
Przed przystąpieniem do szczegółowych eksperymentów należy potwierdzić prawidłową lokalizację oraz wydajną ekspresję białka Rosella.
<ol>
	<li>Za pomocą sterylnych wykałaczek wyselekcjonuj dla każdego szczepu 5 pojedynczych kolonii z płytki po transformacji i zawieś komórki w 50 μl sterylnej wody w oddzielnych sterylnych plastikowych probówkach do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml z zatrzaskową zakrętką.</li>
	<li>Nanieś 10 μl każdej zawiesiny komórkowej na oddzielne, opisane szklane szkiełka przedmiotowe (76 x 26 mm) i przykryj zawiesinę komórkową kwadratowym szkiełkiem nakrywką (22 x 22 mm).</li>
	<li>Natychmiast sprawdź emisję fluorescencji komórek przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego (np. Olympus Fluoview FV500). Poszukaj silnej zielonej i czerwonej fluorescencji oraz znakowania typowego dla lokalizacji mitochondrialnej (Rys. 2B i 2C).</li>
	<li>Pozostałą część każdej kolonii badanej w ten sposób pod kątem fluorescencji należy zaszczepić na nową płytkę wzrostową YMM.</li>
	<li>Inkubuj płytki w temperaturze 28-30°C przez 2 dni, aż kolonie osiągną średnicę około 2-3 mm.</li>
</ol>
3. Wzrost komórek i indukcja autofagii
Autofagię można indukować przy użyciu szeregu różnych warunków eksperymentalnych, w tym poprzez wprowadzenie komórek w fazę stacjonarną, zmianę źródła węgla, podanie rapamycyny lub głodzenie azotowe. W naszej rutynowej praktyce stosujemy głodzenie azotowe jako metodę indukcji mitofagii.
<ol>
	<li>Zaszczep pojedynczą kolonię w 10 ml pożywki wzrostowej zawierającej etanol oraz odpowiednie suplementy aukstroficzne.</li>
	<li>Inkubować kultury drożdży w temperaturze 28-30°C przy wytrząsaniu orbitalnym (200 rpm) przez około 48 godzin. Komórki powinny znajdować się w środkowej fazie wzrostu logarytmicznego.</li>
	<li>Osadzić komórki z dwóch powtórnych próbek hodowli o objętości 1 ml w sterylnych plastikowych probówkach wirówkowych z zakrętką typu snap o pojemności 1,7 ml poprzez wirowanie przy 2,000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć i odrzucić nadsącz, nie naruszając osadu komórkowego.</li>
	<li>Przemyć komórki trzykrotnie 1 ml sterylnej wody destylowanej poprzez resuspensję, a następnie wirowanie w celu usunięcia pozostałości pożywki.</li>
	<li>Po trzecim przemyciu resuspender komórki w 100 ml pożywki wzrostowej lub pożywki z ograniczeniem azotu.</li>
	<li>Ponownie zaszczep resuspenderowane komórki w 10 ml świeżej pożywki wzrostowej lub w 10 ml pożywki z ograniczeniem azotu. Inkubować przy wytrząsaniu orbitalnym przez 6-12 godzin, aby umożliwić indukcję mitofagii. Po okresie głodzenia przygotować komórki do obserwacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
</ol>
Uwaga: Znakowanie wakuoli CMAC-Arg
Podczas pierwszego etapu opracowywania testu przydatne jest potwierdzenie pod mikroskopem fluorescencyjnym dostarczenia Rosella do wakuoli. Choć wakuola drożdży jest dużym organellum, którego położenie często można łatwo określić na podstawie obrazów w świetle przechodzącym, w niektórych szczepach drożdży i w określonych warunkach wzrostu wakuola może być pofragmentowana i trudna do zlokalizowania.
Wakuolę można łatwo oznakować przy użyciu barwnika wakuolarnego opartego na kumarynie, takiego jak CMAC-Arg (7-amino-4-chlorometylokumaryna, amid L-argininy). Działanie proteaz wakuolarnych na barwnik skutkuje jasnoniebieską fluorescencją wakuoli. Emisja niebieska jest łatwo odróżnialna od emisji czerwonej i zielonej Rosella11. Oznakowanie CMAC-Arg nie musi być wykonywane rutynowo, ale jest zalecane osobom, które nie są zaznajomione z lokalizacją i wyglądem wakuoli w drożdżach.
4. Znakowanie wakuoli CMAC-Arg
<ol>
	<li>Przed obrazowaniem dodać CMAC-Arg (stężenie końcowe 100 mM) do komórek w fazie wzrostu lub komórek z niedoborem azotu. Roztwór CMAC-Arg można przygotować wcześniej, jednak ze względu na jego światłoczułość należy chronić go przed ekspozycją na światło.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 28-30°C przy wytrząsaniu orbitalnym (200 rpm) przez 30 minut.</li>
	<li>Zbiór komórek przeprowadzić poprzez wirowanie z prędkością 2,000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odlać nadsącz.</li>
	<li>Komórki przemyć trzykrotnie sterylną wodą destylowaną poprzez resuspensję i następujące po niej wirowanie, aby usunąć pozostałości pożywki oraz nadmiar barwnika CMAC-Arg.</li>
	<li>Przygotować preparat komórek do obrazowania zgodnie z opisem poniżej.</li>
</ol>
5. Montowanie żywych komórek drożdży do konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej (CLSM)
<ol>
	<li>Roztopić 2 mg agarozy o niskiej temperaturze topnienia w osobnych alikwotach 1 ml pożywki wzrostowej oraz pożywki z deficytem azotu, inkubując je w temperaturze 70°C. Roztopioną agarozę utrzymywać w temperaturze 70°C.</li>
	<li>Delikatnie osadzić komórki w alikwotach 1 ml każdej z kultur komórkowych poprzez wirowanie przy 2,000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie odrzucić nadsącz.</li>
	<li>Przemyć komórki trzykrotnie 1 ml sterylnej wody destylowanej poprzez resuspensję i wirowanie, analogicznie do kroku 5.2.</li>
	<li>Resuspendować przemyte komórki w 100 μl sterylnej wody destylowanej.</li>
	<li>W celu zamontowania komórek nanieść 20 μl roztopionej agarozy na oznakowane szklane szkiełko przedmiotowe (76 x 26 mm).</li>
	<li>Niezwłocznie nanieść 10 μl zawiesiny przemytych komórek na warstwę agarozy.</li>
	<li>Przykryć warstwę agarozy szkiełkiem nakrywką (22 x 22 mm). Komórki rozprzestrzenią się po powierzchni agarozy pod szkiełkiem nakrywką.</li>
	<li>Aby zapobiec odwodnieniu i przesunięciu się szkiełka nakrywką podczas obrazowania, ostrożnie uszczelnić krawędzie szkiełka cienką warstwą lakieru do paznokci.</li>
	<li>Gdy lakier do paznokci całkowicie wyschnie (10 min), preparat jest gotowy do obserwacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Uwaga: lakier do paznokci może uszkodzić obiektywy mikroskopu.</li>
	<li>Komórki zamontowane tą techniką można obserwować do 1 godziny po przygotowaniu preparatu.</li>
</ol>
6. Wizualizacja autofagii z wykorzystaniem CLSM
Poziom autofagii w populacji komórek jest rutynowo oceniany poprzez określenie liczby komórek wykazujących czerwoną fluorescencję wakuol przed i po indukcji autofagii. W idealnych warunkach postęp autofagii monitoruje się w wybranych punktach czasowych po indukcji autofagii (Rys. 3). Najlepiej przeprowadzić to, obserwując próbki przez okular mikroskopu. Ważne jest zastosowanie odpowiednich kontroli (np. mutanta Δatg3) oraz utrzymanie niezmiennych ustawień mikroskopu podczas obserwacji różnych próbek (np. stosowanie filtrów neutralnych lub wybór filtrów).
Komórki drożdży są stosunkowo małe, co wymaga zastosowania wysokiej jakości mikroskopu fluorescencyjnego (np. Olympus Fluoview FV500) wyposażonego w filtry wzbudzenia/emisji odpowiednie do oddzielnej wizualizacji GFP i/lub pHluoriny (emisja fluorescencji zielonej) (filtr FITC) oraz DsRed.T3 (emisja fluorescencji czerwonej) (filtr TRITC).
<ol>
	<li>Używając obiektywu wodnego 60x, obserwuj nienaszyczone komórki typu dzikiego, stosując naprzemiennie filtry FITC i TRITC. Komórki typu dzikiego powinny wykazywać typowy rozkład mitochondriów na peryferiach komórki, wykazując zarówno fluorescencję czerwoną, jak i zieloną. Należy zauważyć, że rozkład mitochondriów zależy od ustawienia przysłony (pinhole) mikroskopu konfokalnego. Zazwyczaj stosujemy niższą wartość przysłony 125 μm, co pozwala na obserwację mitochondriów jako serii kropek zlokalizowanych na peryferiach komórki (Ryc. 2C), dzięki czemu wakuola nie zostaje przesłonięta12. Jeśli zastosowana zostanie wysoka wartość przysłony (200 μm), pozwala to na obserwację typowej włóknistej sieci mitochondrialnej rozproszonej w całej komórce (oraz zmian, jakim ona ulega)11. Żadne inne struktury w komórce nie powinny być znakowane fluorescencyjnie.</li>
	<li>Sekwencyjnie obserwuj komórki w każdym z punktów czasowych po przeniesieniu do pożywki głodzeniowej. Wizualizuj je naprzemiennie za pomocą zielonego i czerwonego filtra emisyjnego. W punkcie czasowym 6 h głodzenia w wakuoli powinna być widoczna fluorescencja czerwona, ale brak odpowiadającej jej emisji zielonej. Lokalizację wakuolarną można potwierdzić osobno za pomocą CMAC-Arg (Ryc. 2C). Przeanalizuj ok. 200 komórek i policz te, które wykazują jedynie fluorescencję czerwoną w wakuoli (tj. wewnątrzkomórkowe pochłanianie mitochondriów przez wakuolę).</li>
	<li>Policz akumulację wakuolarną dla wszystkich punktów czasowych, obserwując &gt;200 komórek, a następnie wykreśl procent komórek wykazujących akumulację wakuolarną.</li>
	<li>Zbadaj komórki kontrolne z ujemną autofagią ekspresujące mt-Rosella przed głodzeniem oraz po 6 h głodzenia.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki:
W niniejszym doświadczeniu przedstawiamy typowe wyniki uzyskane przy użyciu mt-Rosella, wyrażone w komórkach typu dzikiego oraz komórkach mutantów Δatg3. W warunkach hodowli z etanolem jako źródłem węgla, zarówno komórki typu dzikiego, jak i mutanty Δatg3 wykazują rozkład fluorescencji (czerwonej i zielonej) w komórce typowy dla mitochondriów w komórkach drożdży. Emisja fluorescencji czerwonej i zielonej nie jest wykrywana w wakuoli (Rys. 2B i 2C). Po poddaniu komórek głodzeniu azotowemu przez 6 h i dłużej, w komórkach typu dzikiego, oprócz fluorescencji czerwonej i zielonej odpowiadającej mitochondriom, obserwuje się również gromadzenie fluorescencji czerwonej, ale nie zielonej, w świetle wakuoli (Rys. 2B; Rys. 3). Jednak w komórkach mutantów Δatg3 ani fluorescencja czerwona, ani zielona nie gromadzi się w świetle wakuoli (Rys. 2C; Rys. 3). 
<img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig1.jpg" alt="Schemat procesu autofagii; zaangażowane organelle komórkowe; sygnały głodzenia; potrzeby wewnątrzkomórkowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Góra, schemat organelli i przedziałów w komórce drożdży. Na dole przedstawiono widok komórki drożdży z centrum w wakuoli, wskazujący na autofagiczną degradację różnych organelli i przedziałów. Do różnic między poszczególnymi typami autofagii specyficznych dla organelli (np. mitofagia, nukleofagia) należą specyficzność (wybór ładunku) pochłoniętej zawartości, różne potrzeby wewnątrzkomórkowe i sygnały zewnątrzkomórkowe (np. głodzenie, uszkodzenia), specyficzne sygnały, geny ATG oraz zależność od czasu. 
<img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2a.jpg" alt="Schemat wskaźnika pH ekspresji białka, emisja fluorescencji przy 508nm, wzbudzenie 488nm." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2a"> 
<img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2b.jpg" alt="Odpowiedź komórkowa na głodzenie azotowe, schemat komórek typu dzikiego vs mutantów Δatg3, zmiany w wakuoli." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2b"> 
<img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2c.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna rosnących i głodzonych azotowo komórek typu dzikiego; DIC, DsRed, pHluorin, CMAC." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2c"> 
<img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2d.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna komórek mutantów Δatg3 w warunkach wzrostu i głodzenia azotowego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2d"> 
Rycina 2. (A) Schematyczna reprezentacja mt-Rosella. Sekwencja sygnałowa mitochondrium (w tym przypadku syntazy cytrynianowej) służy do kierowania biosensora Rosella do macierzy mitochondrialnej. Wskazano maksima wzbudzenia i emisji dla czerwonego białka fluorescencyjnego (DsRed.T3) oraz zielonego białka fluorescencyjnego (pHluorin). Przy wysokim pH (pH mitochondrialne ~8,2) biosensor fluoreskuje zarówno na czerwono, jak i na zielono, natomiast przy niskim pH (pH wakuolarne ~5,5) fluoreskuje tylko na czerwono.
(B) Schematyczna reprezentacja oczekiwanych wyników w komórkach typu dzikiego i mutantach Δatg3 ekspresujących mt-Rosella. 
(C) Rzeczywiste wyniki uzyskane za pomocą CLSM dla komórek typu dzikiego w warunkach wzrostu i głodzenia azotowego. Od lewej do prawej: DIC (mikroskopia kontrastowo-fazowa), emisja fluorescencji RFP (DsRed.T3), emisja fluorescencji GFP (pHluorin), fluorescencja CMAC-Arg i obraz z nałożeniem (merge).
(D) Rzeczywiste wyniki uzyskane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej dla komórek mutantów Datg3 w warunkach wzrostu i głodzenia azotowego. Od lewej do prawej: DIC (mikroskopia kontrastowo-fazowa), emisja fluorescencji RFP (DsRed.T3), emisja fluorescencji GFP (pHluorin), fluorescencja CMAC-Arg i obraz z nałożeniem (merge).
<img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig3.jpg" alt="Wykres akumulacji fluorescencji komórkowej; czas vs. fluorescencja; porównanie procentowe typu dzikiego i Δatg3." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Procent komórek typu dzikiego oraz mutantów Δatg3, wykazujących ekspresję mt-Rosella i hodowanych w warunkach głodowania azotowego, które wykazują czerwoną fluorescencję w wakuoli w czasie 48 godzin. Procent komórek wykazujących akumulację czerwonej fluorescencji w wakuoli zapisano w 0, 6, 12, 24 i 48 godzinach po rozpoczęciu głodowania azotowego.

<ol><li>Levine, B., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+the+pathogenesis+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy in the pathogenesis of disease.</a> Cell. 132, 27-42 (2008).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li>
<li>He, C., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+mechanisms+and+signaling+pathways+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy.</a> Annu. Rev. Genet. 43, 67-93 (2009).</li>
<li>Kroemer, G., Mariño, G., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+the+integrated+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy and the integrated stress response.</a> Mol Cell. 40, 280-293 (2010).</li>
<li>Camougrand, N., Kissová, I., Salin, B., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+mitophagy+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Monitoring mitophagy in yeast.</a> Methods Enzymol. 451, 89-107 (2008).</li>
<li>Yen, W. L., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+live+long+and+prosper%3A+autophagy%2C+mitochondria%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">How to live long and prosper: autophagy, mitochondria, and aging.</a> Physiology (Bethesda). 23, 248-262 (2008).</li>
<li>Tolkovsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitophagy.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1793, 1508-1515 (2009).</li>
<li>Bhatia-Kissová, I., Camougrand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+in+yeast%3A+actors+and+physiological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Mitophagy in yeast: actors and physiological roles.</a> FEMS Yeast Res. 10, 1023-1034 (2010).</li>
<li>Kanki, T., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+mechanism+of+mitochondria+autophagy+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The molecular mechanism of mitochondria autophagy in yeast.</a> Mol. Microbiol. 75, 795-800 (2010).</li>
<li>Nowikovsky, K., Reipert, S., Devenish, R. J., Schweyen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm38+protein+depletion+causes+loss+of+mitochondrial+K%2B%2FH%2B+exchange+activity%2C+osmotic+swelling+and+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Mdm38 protein depletion causes loss of mitochondrial K+/H+ exchange activity, osmotic swelling and mitophagy.</a> Cell Death Differ. 14, 1647-1656 (2007).</li>
<li>Devenish, R. J., Prescott, M., Turcic, K., Mijaljica, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+organelle+turnover+in+yeast+using+fluorescent+protein+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Monitoring organelle turnover in yeast using fluorescent protein tags.</a> Methods Enzymol. 451, 109-131 (2008).</li>
<li>Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosella%3A+a+fluorescent+pH-biosensor+for+reporting+vacuolar+turnover+of+cytosol+and+organelles+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast.</a> Autophagy. 4, 205-213 (2008).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate%2Fsingle-stranded+carrier+DNA%2Fpolyethylene+glycol+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Na reprezentatywnych obrazach przedstawionych na Ryc. 2B i 2C wyraźnie widać, że zastosowanie organellowo-specyficznych reporterów fluorescencyjnych oraz mikroskopii fluorescencyjnej dostarcza dowodów na lokalizację/rozmieszczenie mitochondriów zarówno w komórkach rosnących, jak i w komórkach z głodem azotowym, a także pozwala na wizualizację mitofagii.
Należy podkreślić, że metoda ta nie ogranicza się jedynie do śledzenia mitofagii. Autofagia innych komponentów komórkowych lub organelli (np. rybosomów, kropel lipidowych, peroksysomów, retikulum endoplazmatycznego i jądra komórkowego) może być monitorowana przy użyciu odpowiedniego znakowania. Szczegóły dotyczące konstrukcji biosensora Rosella, warunków hodowli komórkowej oraz typowe wyniki dla obrotu jądra komórkowego (nukleofagii) zostały opisane w literaturze11,12, co ilustruje szersze zastosowanie tej metody.
Stosowanie organellowo-specyficznych fluorescencyjnych reporterów do monitorowania autofagii wymaga uwzględnienia kilku kwestii dotyczących projektowania konstruktów. Należą do nich: (1) wybór i fuzja z odpowiednim sygnałem kierującym w celu uzyskania specyficznego targetowania do organelli; (2) wybór odpowiedniego białka (lub białek) fluorescencyjnych; (3) silna emisja fluorescencji; (4) prawidłowa lokalizacja i/lub rozkład organelli w komórce. Po pomyślnym wyrażeniu organellowo-specyficznego reportera w wybranym szczepie drożdży gospodarza, istotna staje się druga grupa rozważań: (1) warunki wzrostu drożdży; (2) przygotowanie próbek komórkowych; (3) parametry obrazowania, ponieważ ważne jest, aby parametry wybrane dla CLSM (np. intensywność lasera, szybkość i tryb skanowania, wartość pinhole, wartość zoomu, użyte obiektywy lub czas ekspozycji dla kamery CCD) były utrzymane przez cały eksperyment, co zapewni możliwość porównania próbek kontrolnych (rosnących komórek) i próbek głodzonych; (3) indukcja autofagii i pomyślne dostarczenie reportera do wakuoli.
Podsumowując, ta metoda mikroskopii fluorescencyjnej jest prosta, stosunkowo szybka i może znaleźć zastosowanie w wysokoprzepustowym przesiewaniu nowych leków wzmacniających lub hamujących autofagię, a także genów regulujących lub modulujących ten proces.

analiza z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania mitofagii w drożdżach saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autofagia jest istotna dla wymiany komponentów komórkowych w wielu różnych warunkach. Pełni ona kluczową funkcję homeostatyczną, a także służy jako mechanizm kontroli jakości, który może celować w materiał komórkowy, w tym organelle, i selektywnie go degradować1-4. Na przykład uszkodzone lub nadmiarowe mitochondria (Ryc. 1), których nie usunięto w procesie autofagii, mogą stanowić zagrożenie dla homeostazy komórkowej i przeżycia komórki. U drożdży, Saccharomyces cerevisiae, niedobór składników odżywczych (np. głodzenie azotowe) lub uszkodzenia mogą promować selektywną wymianę mitochondriów poprzez autofagię w procesie zwanym mitofagią 5-9.
Opisujemy prostą metodę mikroskopii fluorescencyjnej służącą do oceny autofagii. Dla przejrzystości ograniczamy nasz opis do wykazania, w jaki sposób podejście to może być wykorzystane do monitorowania mitofagii w komórkach drożdży. Analiza wykorzystuje fluorescencyjny reporter Rosella, który jest biosensorem o podwójnej emisji, składającym się z względnie stabilnego w zakresie pH czerwonego białka fluorescencyjnego połączonego z wrażliwym na pH zielonym białkiem fluorescencyjnym. Działanie tego reportera opiera się na różnicach pH między wakuolą (pH ~ 5,0-5,5) a mitochondriami (pH ~ 8,2) w żywych komórkach. W warunkach wzrostu komórki typu dzikiego wykazują zarówno czerwoną, jak i zieloną fluorescencję rozmieszczoną w sposób charakterystyczny dla mitochondriów. Emisja fluorescencji nie jest związana z wakuolą. Po poddaniu komórki głodzeniu azotowemu, czyli warunkowi indukującemu mitofagię, oprócz czerwonej i zielonej fluorescencji znakującej mitochondria, w komórkach obserwuje się akumulację fluorescencji czerwonej, ale nie zielonej, w kwaśnym świetle wakuoli, co reprezentuje dostarczanie mitochondriów do wakuoli. Zliczanie komórek z czerwonymi, ale nie zielonymi fluorescencyjnymi wakuolami może służyć jako miara aktywności mitofagicznej w komórkach5,10-12.

Opisano niezawodną metodę monitorowania transportu organelli do kwaśnego światła wakuoli drożdżowej w celu ich degradacji i recyklingu. Metoda ta opiera się na specyficznym znakowaniu docelowych organelli za pomocą genetycznie kodowanego dwuemisyjnego fluorescencyjnego biosensora pH oraz wizualizacji pojedynczych komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Analiza z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania mitofagii w drożdżach Saccharomyces cerevisiae

Autofagia jest istotna dla wymiany komponentów komórkowych w szerokim zakresie różnych warunków. Pełni ona kluczową funkcję homeostatyczną, a także...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest śledzenie pobierania mitochondriów do wakuoli jako metoda badania autofagii mitochondriów, procesu znanego jako mitofagia. Osiąga się to poprzez ekspresję w komórkach drożdży genetycznie zakodowanego i celowanego w mitochondria dwuemisyjnego fluorescencyjnego biosensora pH o nazwie Mt Rosea, który znakuje mitochondria fluorescencją czerwoną i zieloną. W drugim kroku komórki drożdży poddaje się głodzeniu azotowemu w celu indukcji autofagii.Następnie komórki badamy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej mikroskopii skaningowej, aby zwizualizować wychwyt mitochondriów do va. Uzyskane wyniki wykazują akumulację fluorescencji czerwonej, ale nie zielonej, w VAs komórek głodzonych azotowo. Pozwala to na ocenę autofagii w populacji komórek, co umożliwia określenie stopnia mitofagii.Wykorzystanie rosea do monitorowania wychwytu mitochondriów do wakuoli komórek drożdży może dostarczyć wglądu w mechanizmy procesu mii. Podejście to można dostosować do monitorowania autofagii innych organelli komórkowych, takich jak jądro komórkowe; procedurę tę zademonstruje dalibor alica, badacz postdoktorski z naszego laboratorium. W niniejszym protokole wykorzystujemy szczep typu dzikiego BY 4 7 41 oraz szczep z mutacją delecyjną delta A TG three, pochodzące z tego samego tła genetycznego, aby zwizualizować lokalizację mitochondriów.W szczepach tych są one znakowane reporterem fluorescencyjnym. Rosea Rosea to dwukolorowy biosensor emisyjny składający się z białka fluorescencyjnego czerwonego, stosunkowo stabilnego względem pH, oraz białka fluorescencyjnego zielonego, wrażliwego na pH. Sekwencja docelowa mitochondrialna jest wykorzystywana do ukierunkowania biosensora Rosea do macierzy mitochondrialnej.Reporter ten został nazwany Mt.Rosea; przy wysokim pH biosensor fluorescuje zarówno na czerwono, jak i na zielono. Jednak przy niskim pH fluorescuje on jedynie na czerwono. Szczep typu dzikiego służy jako kontrola do określenia poziomów autofagii normalnie spodziewanych w kontroli negatywnej.Odpowiedni będzie szczep z delecją genu niezbędnego dla procesu autofagii. Ponieważ taki szczep nie może transportować mitochondriów do wakuoli, stosuje się standardowe procedury w celu transformacji szczepów drożdży plazmidem zawierającym reporter rosala ukierunkowany na mitochondria. Płytki z pożywką są inkubowane od dwóch do czterech dni w temperaturze od 28 do 30 °C, aż do pojawienia się kolonii o średnicy około dwóch do trzech milimetrów. Aby namnożyć komórki do indukcji autofagii, należy zaszczepić pojedynczą kolonię drożdży każdego szczepu w 10 ml pożywki zawierającej niefermentowalne źródło węgla.W tym przypadku zastosowano etanol i odpowiednie suplementy troficzne. Dla każdego szczepu hodowano kultury dubletowe, co dało łącznie cztery kultury. Kultury drożdży inkubowano przez około 48 godzin w temperaturze od 28 do 30 °C przy wytrząsaniu orbitalnym; do tego czasu kultury powinny znajdować się w średniej fazie logarytmicznej wzrostu.Po zakończeniu okresu inkubacji przenieś dwie próbki po 1 mL każdej z kultur do probówek wirówkowych z plastikową zakrętką typu snap cap o pojemności 1,7 mL. Delikatnie osadź komórki poprzez wirowanie z niską prędkością. Po wirowaniu ostrożnie usuń i odrzuć nadsącz z każdej probówki, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego.Przemyj komórki za pomocą jednego mililitra sterylnej wody destylowanej poprzez resuspensję, a następnie przeprowadź wirowanie. Powtórz proces płukania jeszcze dwukrotnie, aby usunąć pozostałości medium. Po trzecim przemyciu resuspenduj komórki w 100 µL medium wzrostowego lub medium do głodzenia azotowego.Pożywka do głodzenia azotowego zawiera etanol jako źródło węgla, lecz jest pozbawiona dodatków azotu, co indukuje autofagię w komórkach. Następnie ponownie zaszczepić resuspenderowane komórki do 10 mililitrów świeżej pożywki wzrostowej lub do 10 mililitrów pożywki do głodzenia azotowego.Inkubować kultury w wytrząsarce orbitalnej przez 6 do 12 godzin po indukcji autofagii. Wskazane jest potwierdzenie dostarczenia Mt Rosea do vae pod mikroskopem fluorescencyjnym. Vae można zlokalizować poprzez znakowanie przy użyciu niebieskiego barwnika fluorescencyjnego na bazie kumaryny, takiego jak siedmioaminowy czterochlormetylokumaryna, w skrócie L arginine mi cmac arg.Barwienie cmac ARG nie musi być wykonywane rutynowo, lecz jest zalecane osobom, które nie są zaznajomione z lokalizacją i wyglądem wakuoli w drożdżach. Aby rozpocząć procedurę barwienia wakuoli, przenieś próbki każdego z kultur o objętości jednego mililitra do osobnych plastikowych probówek wirówkowych o pojemności 1,7 mililitra z zakrętką typu snap cap. Następnie dodaj cmac arg do każdej probówki.Inkubuj probówki w temperaturze od 28 do 30 stopni Celsjusza przy potrząsaniu orbitalnym przez 30 minut. Po 30 minutach odwiruj komórki w wirowce, odlej supernatant, a następnie przemyj komórki poprzez zawieszenie w jednym mililitrze sterylnej wody destylowanej i ponowne wirowanie. Przemyj komórki sterylną wodą destylowaną jeszcze dwa razy.Ten krok pozwala usunąć pozostałości pożywki oraz nadmiar barwnika cmac arg. Po trzecim przemyciu komórki należy ponownie zawiesić w 100 µL sterylnej wody destylowanej. Komórki są teraz gotowe do zamontowania w celu obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.Podczas wykonywania tego protokołu bardzo ważne jest użycie świeżo przekształconych kultur drożdży, aby zapewnić uzyskanie limfocytów T z silnie fluorescencyjnymi mitochondriami. Aby przygotować żywe komórki drożdży do obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, należy najpierw roztopić dwie miligramy agaru o niskiej temperaturze topnienia w oddzielnych alikwotach o objętości jeden mililitr medium wzrostowego oraz medium do głodzenia azotowego, inkubując je w temperaturze 70 °C przez jedną godzinę; roztopiony agar należy utrzymać w temperaturze 70 °C. W celu zamocowania komórek, nanieś 20 µL roztopionego agaru na oznakowane szkiełko przedmiotowe o wymiarach 76 na 26 mm.Natychmiast nanieś 10 µL wypłukanej zawiesiny komórek na podłoże aros. Przykryj podłoże aros szkiełkiem podstawkowym o wymiarach 22 na 22 mm. Komórki rozprzestrzenią się po powierzchni aros pod szkiełkiem.Następnie należy ostrożnie uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowe cienką warstwą laku do paznokci. Zapobiegnie to odparowaniu wody oraz przesuwaniu się szkiełka nakrywkowego podczas obrazowania. Po całkowitym wyschnięciu laku preparaty z zamocowanymi komórkami są gotowe do obserwacji pod mikroskopem fluorescencyjnym. Stosując tę technikę, komórki można obserwować do jednej godziny po zamocowaniu bez żadnych wyraźnych negatywnych skutków.Ponieważ komórki drożdży są stosunkowo małe, niezbędny będzie wysokiej jakości mikroskop fluorescencyjny wyposażony w filtry wzbudzenia i emisji odpowiednie do oddzielnej wizualizacji emisji GFP oraz RFP, a także obiektyw imersyjny z wodą o powiększeniu 60x i aperturą numeryczną 1,2. Typowe wyniki uzyskane przy użyciu MT Rosea ekspresjonowanego w komórkach typu dzikiego z zastosowaniem konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej są tutaj przedstawione w warunkach braku głodu, z etanolem jako źródłem węgla, podczas gdy komórki typu dzikiego wykazują typowy wewnątrzkomórkowy rozkład mitochondriów na obwodzie komórek drożdży, które wykazują zarówno fluorescencję czerwoną, jak i zieloną.W wakuoli nie wykryto emisji fluorescencji czerwonej ani zielonej. Gdy komórki typu dzikiego wykazujące ekspresję MT.Rosea zostaną poddane głodzeniu azotowemu przez sześć godzin i dłużej, wykazują one, oprócz fluorescencji czerwonej i zielonej odpowiadającej mitochondriom, akumulację fluorescencji czerwonej, lecz nie zielonej, w wakuoli.Ten sygnał komórkowy świadczy o zachodzeniu autofagii. Autofagiczna absorpcja mitochondriów w komórkach. Lokalizację rosea można potwierdzić oddzielnie, wykorzystując CMAC arg.W przeciwieństwie do nich, w komórkach kontrolnych ujemnych pod kątem mitofagii wykazujących MT.Rosea, obserwowanych przed zagłodzeniem oraz po sześciu i więcej godzinach zagłodzenia, nie zaobserwowano akumulacji czerwonej fluorescencji w wakuoli. Podczas gdy znakowanie mitochondriów pozostawało silne w celu oceny poziomu autofagii w szczepach typu dzikiego oraz mutantach delta ATG3, w ponad 200 komórkach na szczep obserwowano akumulację czerwonej fluorescencji w wakuoli przed indukcją autofagii oraz w wybranych punktach czasowych po jej indukcji. Wykres proporcji komórek wykazujących akumulację wakuolarną ujawnia, że stopień poboru wakuolarnego wzrasta wraz z czasem w komórkach typu dzikiego, ale nie w komórkach mutantów delta ATG3, które nie są w stanie dostarczyć mitochondriów do wakuoli po jej powstaniu. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie autofagii do analizy transportu mitochondriów oraz innych organelli, takich jak jądro komórkowe, do wakuoli w różnych warunkach wzrostu tych komórek.

a-fluorescence-microscopy-assay-for-monitoring-mitophagy-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania mitofagii w drożdżach Saccharomyces cerevisiae

Białka fuzyjne z GFP są powszechnie wykorzystywane do wizualizacji organelli za pomocą mikroskopii konfokalnej. Jednak przesiewanie mutacji wpływających na morfologię organelli zazwyczaj wymaga indywidualnej mutogenezy i jest czasochłonne. W niniejszej pracy prezentujemy metodę jednoczesnego wprowadzenia markerów organelle-GFP do prawie 5 000 genów nieessentialnych u drożdży.

Wysokoprzepustowa metoda globalnego badania morfologii organelli w *S. cerevisiae*

Drożdże szczapowe, Schizosaccharomyces pombe, stanowią dobry system modelowy do badania podstawowych procesów komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowej analizy żywych komórek drożdży szczapowych. W tym konkretnym doświadczeniu skupiamy się na organizacji genomu w obrębie jądra komórkowego, jednak metoda ta może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Ten artykuł opisuje użycie białka fuzyjnego lucyferazy świetlika i GFP do badania in vivo fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae.  Za pomocą tego odczynnika można jednocześnie monitorować fałdowanie modelowego białka zdenaturowanego termicznie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i testu enzymatycznego w celu zbadania roli składników sieci proteostazy w kontroli jakości białka.

Sprzężone testy do monitorowania ponownego fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae

Prezentowane są dwie uzupełniające się metody oparte na cytometrii przepływowej i mikroskopii, które umożliwiają ilościowe określenie, na poziomie pojedynczej komórki, dynamiki ekspresji genów indukowanej aktywacją szlaku MAPK u drożdży.

Kwantyfikacja czasowa ekspresji indukowanej MAPK w pojedynczych komórkach drożdży

Tutaj szczegółowo opisujemy podejście do pomiaru czasowej rekrutacji EYFP-Parkiny za pomocą poklatkowej mikroskopii podczas selektywnego usuwania uszkodzonych mitochondriów. Ten dynamiczny proces usuwania uszkodzonych mitochondriów zależny od EYFP-Parkina może być wykorzystany jako wskaźnik zdrowia komórek w różnych warunkach eksperymentalnych.

Wideomikroskopia poklatkowa do oceny agregacji EYFP-Parkiny jako markera mitofagii komórkowej

Mitofagia, proces oczyszczania uszkodzonych mitochondriów, jest niezbędny do homeostazy mitochondriów i utrzymania zdrowia. W tym artykule przedstawiono niektóre z najnowszych metod wykrywania mitofagii w komórkach ludzkich, Caenorhabditis elegans i myszach.

Wykrywanie mitofagii in vitro i in vivo w komórkach ludzkich, C. elegans i myszach

Mitofagia, selektywna degradacja mitochondriów, jest związana z homeostazą mitochondriów i jest rozregulowana w różnych chorobach ludzkich. Jednak wygodne metody eksperymentalne do pomiaru aktywności mitofagii są bardzo ograniczone. Tutaj zapewniamy czuły test do pomiaru aktywności mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej.

Czuły pomiar mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu zależnego od pH reportera fluorescencyjnego mt-Keima

Tutaj prezentujemy obrazowanie żywych komórek, które jest nietoksyczną metodą mikroskopii, która pozwala badaczom badać zachowanie białek i dynamikę jądrową w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych podczas mitozy i mejozy.

Badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Mitofagia jest głównym mechanizmem kontroli jakości mitochondriów. Jednak ocena mitofagii in vivo jest utrudniona ze względu na brak wiarygodnych testów ilościowych. Przedstawiono protokół obserwacji mitofagii w żywych komórkach przy użyciu barwnika mitochondriów o barwie zielonej fluorescencji i barwnika lizosomowego o czerwonej fluorescencji.

Wizualizacja mitofagii za pomocą barwników fluorescencyjnych dla mitochondriów i lizosomów

Badanie mitofagii za pomocą mikroskopii elektronowej, czujników genetycznych i immunofluorescencji wymaga kosztownego sprzętu, wykwalifikowanego personelu i znacznej inwestycji czasu. Tutaj pokazujemy skuteczność komercyjnego zestawu barwników fluorescencyjnych w ilościowym określaniu procesu mitofagii zarówno w Caenorhabditis elegans, jak i w linii komórkowej raka wątroby.

Wykrywanie mitofagii w Caenorhabditis elegans i komórkach ssaków przy użyciu barwników specyficznych dla organelli

Nadtlenek wodoru (H2O2) jest zarówno źródłem uszkodzeń oksydacyjnych, jak i cząsteczką sygnałową. Protokół ten opisuje, jak mierzyć mitochondrialneH2O2za pomocą ukierunkowanego na mitochondria HyPer7 (mtHyPer7), genetycznie kodowanego biosensora ratiometrycznego, u żywych drożdży. Szczegółowo opisuje, jak zoptymalizować warunki obrazowania i przeprowadzić ilościową analizę komórkową i subkomórkową przy użyciu ogólnodostępnego oprogramowania.

Obrazowanie mtHyPer7, ratiometrycznego biosensora do pomiaru nadtlenku mitochondriów, w żywych komórkach drożdży

Poznaj metodę mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania mitofagii u drożdży Saccharomyces cerevisiae za pomocą biosensora Mt Rosea. Technika ta umożliwia wizualizację degradacji mitochondriów w wakuoli.

Analiza z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania mitofagii w drożdżach Saccharomyces cerevisiae

Przeglądaj więcej filmów