Name: Sekcja wibratomu w celu lepszego zachowania cytoarchitektury ssaczego narządu Cortiego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Poznaj metodę sekcji wibratomowej narządu Corti ssaków z zachowaniem cytoarchitektury komórkowej. Technika umożliwia immunohistochemiczne barwienie i wysokorozdzielczą mikroskopię konfokalową do precyzyjnej identyfikacji typów komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor pragnie podziękować za możliwość skorzystania z zaplecza obrazowania Children's Research Institute Imaging Core w zakresie mikroskopii konfokalnej oraz dr. Jian Zhang za sugestię montowania preparatów z użyciem kulek agarozowych. Praca została sfinansowana z grantu N.I.H. nr DC010387.

1. Izolacja i utrwalenie ucha wewnętrznego
<ol>
 <li>Aby przeanalizować wzorce komórkowe w narządzie Cortiego, przeprowadź eutanazję embrionów w odpowiednim stadium rozwoju lub osobników dorosłych.</li>
 <li>Wypreparuj torebkę słuchową zawierającą błoniastą część ucha wewnętrznego. U myszy można to łatwo przeprowadzić u embrionów od 14,5 dnia embrionalnego (E) i starszych, przyjmując, że E0,5 to dzień stwierdzenia obecności czopa pochwowego. Preparację torebki słuchowej rozpoczyna się od odcięcia głowy i otwarcia czaszki w linii środkowej. Usuń mózg, aby odsłonić oba uszy (Rys. 1A). Ucha wewnętrzne można ostrożnie wyjąć w całości za pomocą pęsety (np. Dumont #5, Rys. 1B). W przypadku obrazowania narządu Cortiego nie jest konieczne dokładne usuwanie wszystkich tkanek neuronalnych i łącznych związanych z torebką słuchową.</li>
 <li>Utrwal całe ucha wewnętrzne poprzez zanurzenie w 4% paraformaldehydzie (PFA) przy łagodnym kołysaniu w temperaturze 4°C przez noc, w probówkach NUNC Cryo-tube z nakrętką o pojemności 1,8 ml lub innym odpowiednio dobranym pojemniku. Roztwór PFA należy przygotować na świeżo w ddH20, a następnie przechowywać w temperaturze -20°C do momentu użycia.</li>
 <li>Następnego dnia wypłucz utrwalacz, trzykrotnie wymieniając 1X fosforan buforowany roztwór soli (PBS). Tkankę można przechowywać w sterylnym 1X PBS od kilku dni do kilku miesięcy aż do rozpoczęcia dalszej obróbki. W przypadku tkanki dorosłych osobników przeprowadź dekalcyfikację w 10% EDTA (0,27 M) w temperaturze 4°C przez 5 dni, a następnie przepłucz i przechowuj w 1X PBS.</li>
 
</ol>

2. Wycinanie sekcji w wibratomie

<ol>
 <li>Przygotować 4% agarozę o niskiej temperaturze topnienia (Low Melting Point agarose) w 1X PBS. Dodać agarozę o niskiej temperaturze topnienia do 1X PBS i podgrzewać w kuchence mikrofalowej aż do całkowitego rozpuszczenia. Należy uważać, aby roztwór nie wykipiał – okresowo wyjmować go z kuchenki i delikatnie mieszać ruchem wirowym. Roztwór przechowywać w łaźni wodnej o temperaturze 55°C do momentu użycia.</li>
 <li>Za pomocą pęsety wyjąć ucho wewnętrzne z roztworu 1X PBS i umieścić na dnie formy do zatapiania typu Peel-A-Way. Pipetą usunąć nadmiar 1X PBS z formy. Wypełnić formę obfitą ilością płynnej 4% agarozy o niskiej temperaturze topnienia, tak aby całkowicie przykryła tkankę (Ryc. 2A).</li>
 <li>Ustawić ucho wewnętrzne do sekcjonowania w odpowiedniej płaszczyźnie. Dobre przekroje poprzeczne narządu Cortiego uzyskano poprzez przybliżenie pozycji torebki słuchowej tak, jak gdyby pozostawała ona in situ w głowie, i sekcjonowanie w płaszczyźnie poprzecznej. W przypadku embrionów E14.5 oraz osobników dorosłych ustawić ucho wewnętrzne tak, aby było widoczne od strony bocznej, z widocznym bocznym kanałem półkolistym (Ryc. 2B). Ustawić ucho wewnętrzne pod kątem, tak aby linia tworzona przez tylną stronę torebki słuchowej znajdowała się pod kątem około 45 stopni względem zamierzonej płaszczyzny sekcjonowania (Ryc. 2A, B). Gdy torebka słuchowa jest ustawiona tak, że jej część grzbietowa znajduje się u góry, zwój podstawowy ślimaka powinien znajdować się na dole (grot strzałki, Ryc. 2B), a przedni kanał półkolisty (asc) u góry (Ryc. 2B).</li>
 <li>Agaroza stężeje w temperaturze pokojowej w ciągu 30 min. Przenieść formy Peel-Away z zatopioną tkanką do temperatury 4°C do momentu sekcjonowania. Jeśli sekcjonowanie zostanie odroczone do następnego dnia, dodać 1X PBS, aby przykryć agarozę w formie, i przechowywać w pudełku z wilgotnymi ręcznikami papierowymi nasączonymi 1X PBS.</li>
 <li>Zdjąć plastikową formę. Za pomocą żyletki wyciąć blok agarozy zawierający tkankę ucha wewnętrznego. Należy zadbać o to, aby płaszczyzna sekcji była prosta i równoległa do przeciwległej strony bloku, która będzie powierzchnią, na której blok agarozy zostanie przyklejony. Ponieważ agaroza nie infiltruje tkanki, nie należy usuwać zbyt dużej ilości agarozy z okolic tkanki, aby zapewnić jej odpowiednie podparcie.</li>
 <li>Użyć superglue, aby przymocować blok do powierzchni tnącej.</li>
 <li>Wykonować sekcje o grubości od 40 do 100 μm za pomocą wibratomu. Przechowywać skrawki w naczyniu hodowlanym wypełnionym 1X PBS z 0.1% TritonX-100. Reprezentatywny przekrój przez spiralę ślimaka przedstawiono na Ryc. 2C.</li>
 <li>Za pomocą pęsety oddzielić agarozę od tkanki. Agaroza nie przenika do wnętrza tkanki, a jedynie przylega do zewnętrznej powierzchni ucha wewnętrznego.</li>
 <li>W razie potrzeby połączyć sekcje tkanki pozbawione agarozy, używając pipety z szerokim otworem, aby zapobiec nadmiernemu ścinaniu tkanki. W przypadku przeprowadzania wielu barwień przeciwciałami na różnych tkankach, skrawki można zorganizować w 16- lub 24-dołkowej płytce hodowlanej.</li> 
</ol>
3. Barwienie przeciwciałami skrawków z wibratomu
Przejdź do barwienia przeciwciałami. Przetwórz przekroje w całości, w formie wolno pływającej w roztworze. Poniżej znajduje się przykładowy protokół barwienia przeciwciałami dla markera S100 komórek filarowych narządu Cortiego, jednak protokół ten można zastosować dla dowolnego przeciwciała. Wszystkie etapy płukania przeprowadza się w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
<ol>
 <li>W wielodołkowej płytce do hodowli tkanek inkubować swobodnie pływające przekroje w PBT (1X PBS, 1% albuminy surowicy bydlęcej, 0,1% Triton X-100) przez 30 min, delikatnie kołysząc płytką.</li>
 <li>Odpipetować stary roztwór i blokować swobodnie pływające przekroje w PBT + normalnej surowicy koziej (50 μl NGS/ 1 ml PBT) przez 30 min, delikatnie kołysząc płytką.</li>
 <li>Odpipetować stary roztwór i dodać przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w PBT + NGS (rozcieńczenie S100 w PBT+NGS 1:200). Inkubować przez noc w temperaturze 4°C, delikatnie kołysząc płytką.</li>
 <li>Odpipetować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego. Przemyć 3X przez 5 min w PBT, a następnie 4X przez 30 min w PBT.</li>
 <li>Blokować w PBT + NGS przez 30 min.</li>
 <li>Inkubować z koniugowanym fluorescencyjnie przeciwciałem wtórnym (pozyskanym z kozy) rozcieńczonym w PBT + NGS. Inkubować przez noc w temperaturze 4°C lub przez kilka godzin w RT, delikatnie kołysząc płytką.</li>
 <li>Odpipetować roztwór przeciwciała wtórnego. Przemyć 3X przez 5 min, a następnie 4X przez 30 min w PBT.</li>
 <li>Odpipetować ostatni roztwór płuczący PBT i zastąpić go odpowiednim wodnym medium montażowym zawierającym barwnik przeciwjądrowy.</li>
</ol>
4. Montowanie skrawków na szkiełkach i mikroskopia konfokalna
Aby zapobiec zmiażdżeniu grubych skrawków przez szkiełko nakrywkowe, podczas montowania pojedynczych sekcji należy umieścić dystans między szkiełkiem podstawowym a nakrywkowym. Poniżej przedstawiono dwie alternatywne metody montowania grubych skrawków przygotowanych za pomocą wibratomu:
<ol>
 <li>
 <ol type="a">
 <li>Dystans można utworzyć, nakładając pierścień smaru próżniowego w kwadracie wokół przekroju tkanki. Dzięki temu podczas nakładania szkiełka nakrywki jego krawędzie zostaną uszczelnione smarem próżniowym. Przycisnąć krawędzie szkiełka nakrywki kciukiem, aby mocno przytwierdzić je do preparasu. Jeśli smar próżniowy jest nałożony starannie i równomiernie wokół wszystkich krawędzi szkiełka nakrywki, preparas będzie wystarczająco uszczelniony do użytku w odwróconym mikroskopie konfokalnym.</li>
 <li>Alternatywnie dystans można utworzyć, używając żywicy do chromatografii agarozowej o znanej wielkości oczek (np. Affi-Gel Blue Gel, Bio-Rad). Nanieść pipetą 1 μl żywicy na preparas w każdym z czterech rogów, w których zostanie umieszczone szkiełko nakrywkowe. Nanieść pipetą jeden przekrój tkanki oraz medium montażowe na środek między cztery kropki żywicy. Przykryć szkiełkiem nakrywką. W przypadku użycia odwróconego mikroskopu konfokalnego, uszczelnić szkiełko nakrywkowe na preparasie za pomocą lakieru do paznokci.</li> 
 </ol> 
 </li>
 <li>Uzyskać przekroje optyczne z barwionych skrawków z wibrotomu przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Aby przeprowadzić kwantyfikację różnych typów komórek w ślimaku (organum Corti), należy wykonać stos obrazów z (z-stack) z określonym krokiem (między 1.5 a 3 μm). Przekroje powinny zostać przeciwbarwione barwnikiem jądrowym (krok 3.8). Obrazy można analizować na dowolnym ekranie komputera po zebraniu danych konfokalnych. Komórki można zliczać ręcznie, obserwując pojawianie się i znikanie jąder podczas sekwencyjnego przeglądania obrazów w stosie z.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Reprezentatywny stos obrazów konfokalnych (z-stack) wykonany na przekroju z wibrotomu, wybarwiony pod kątem białka S100, które występuje w komórkach filarowych i komórkach Deitera, oraz przeciwbarwiony barwnikiem jądrowym (Ryc. 3A-F). Każdy panel przedstawia obraz konfokalny wykonany w krokach co 3 μm, przy czym panel A to obraz uzyskany najbliżej powierzchni przekroju z wibrotomu, a panel F to obraz uzyskany najgłębiej wewnątrz przekroju. Morfologia narządu Cortiego wydaje się być w niewielkim stopniu zaburzona. W szczególności wypustki cytoplazmatyczne komórek filarowych nie są przerwane. Poprzez obserwację pojawiania się i znikania jąder komórek filarowych w stosie z (Ryc. 3A do 3F), można policzyć liczbę zarówno wewnętrznych, jak i zewnętrznych komórek filarowych (patrz numeracja, Ryc. 3A - F). Ze względu na niewielką liczbę komórek każdego typu na pojedynczym obrazie konfokalnym, podejście to może być wykorzystane do zliczania większości typów komórek w obrębie narządu Cortiego.
<img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig1.jpg" alt="Anatomia ucha wewnętrznego żaby; opisany obraz z sekcji przedstawiający kanały półkoliste i struktury ślimaka." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Nienaruszone ucha wewnętrzne dorosłych osobników w wieku 15 tygodni, zamknięte w torebce słuchowej. (A) Prawa torebka słuchowa (oznaczona nawiasem) osadzona w czaszce, widziana z perspektywy wnętrza głowy po usunięciu mózgu. Strona przednia znajduje się po prawej stronie. (B) Nienaruszone ucha wewnętrzne 15-tygodniowych osobników po wypreparowaniu z czaszki. Widoczna jest powierzchnia boczna lewego ucha wewnętrznego oraz powierzchnia przyśrodkowa prawego ucha wewnętrznego. Etykiety wskazują położenie przedniego kanału półkolistego (asc), ślimaka (co) oraz okna owalnego (ow).
<img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig2.jpg" alt="Proces krojenia ucha wewnętrznego; płaszczyzna, schemat anatomiczny, obraz mikroskopowy; analiza edukacyjna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. (A) Całe ucho wewnętrzne od 15-tygodniowego osobnika dorosłego, zatopione w agarozie w centrum formy Peel-Away. Wskazano zamierzoną płaszczyznę cięcia. (B) Zbliżenie całego ucha wewnętrznego 15-tygodniowego osobnika przed zatopieniem. Część otaczającej kości została usunięta, aby labirynt błoniasty był lepiej widoczny. Wyznaczono przebieg bocznego kanału półkolistego (lsc), przedniego kanału półkolistego (asc) oraz ślimaka (co) (białe linie). Wskazano podstawowy zwój ślimaka (grot strzałki) oraz zamierzoną płaszczyznę cięcia (linia przerywana). (C) Reprezentatywny przekrój poprzeczny przez ślimaka. Na jednym z przekrojów przez przewód ślimaka zaznaczono ramką narząd Cortiego (oC), nawiasem stria vascularis (sv) oraz wskazano błonę Reissnera (Rm).
<img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig3.jpg" alt="Immunofluorescencja komórek struktury ślimaka; schemat IHC, OHC na różnych głębokościach; białko S100." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Organ Corti u myszy typu dzikiego w dniu P21. (A-F) Sekwencyjne serie konfokalne, z krokiem 3 μm, przez organ Corti barwiony przeciwciałem przeciwko S100 w celu wizualizacji komórek filarowych i komórek Deitera. Liczba wewnętrznych i zewnętrznych komórek filarowych od początku do końca serii jest ponumerowana. Skróty: IHC (wewnętrzna komórka rzęsata), aIHC (sąsiednia wewnętrzna komórka rzęsata), OHC (zewnętrzna komórka rzęsata), PC (komórka filarowa), DC (komórka Deitera).

<ol><li>Lim, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+structure+of+the+organ+of+Corti%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Functional structure of the organ of Corti: a review.</a> Hear Res. 22, 117-146 (1986).</li>
<li>Raphael, Y., Altschuler, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+innervation+of+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Structure and innervation of the cochlea.</a> Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).</li>
<li>Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp2+signaling+regulates+the+hepatic+versus+pancreatic+fate+decision%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Bmp2 signaling regulates the hepatic versus pancreatic fate decision.</a> Dev Cell. 15, 738-748 (2008).</li>
<li>Sun, X., Mariani, F. V., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+FGF+signalling+from+the+apical+ectodermal+ridge+in+limb+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functions of FGF signalling from the apical ectodermal ridge in limb development.</a> Nature. 418, 501-508 (2002).</li>
<li>Trinh, L. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+regulates+epithelial+organization+during+myocardial+migration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Fibronectin regulates epithelial organization during myocardial migration in zebrafish.</a> Dev Cell. 6, 371-382 (2004).</li>
<li>Yin, C., Kikuchi, K., Hochgreb, T., Poss, K. D., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hand2+regulates+extracellular+matrix+remodeling+essential+for+gut-looping+morphogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Hand2 regulates extracellular matrix remodeling essential for gut-looping morphogenesis in zebrafish.</a> Dev Cell. 18, 973-984 (2010).</li>
<li>Shim, K., Minowada, G., Coling, D. E., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sprouty2%2C+a+mouse+deafness+gene%2C+regulates+cell+fate+decisions+in+the+auditory+sensory+epithelium+by+antagonizing+FGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Sprouty2, a mouse deafness gene, regulates cell fate decisions in the auditory sensory epithelium by antagonizing FGF signaling.</a> Dev Cell. 8, 553-564 (2005).</li>
</ol>

Doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami określonymi przez IACUC Medical College of Wisconsin.

Procedura krojenia w wibrotomie, a następnie immunohistochemia i obrazowanie konfokalne pozwalają na wizualizację narządu Cortiego przy minimalnym uszkodzeniu tkanki. Wyraźnie widać, że obrazy konfokalne pobrane z wewnętrznych obszarów przekroju wykonanego wibrotomem wykazują doskonałe zachowanie morfologii komórkowej, ograniczone jedynie przez artefakty utrwalania. Obrazy konfokalne wykonane blisko dwóch powierzchni cięcia przekroju wibrotomowego są często nieodróżnialne od obrazów z obszarów wewnętrznych, choć zaobserw...

<table><tbody><tr><td>Mikrotom z wibrującym nożem Leica VT1000S</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny mikroskop skaningowy laserowy Zeiss LSM510</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Student Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej temperaturze topnienia UltraPure</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>Forma do zatapiania Peel-A-Way</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18986 or 18646A</td><td></td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Invitrogen</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>S100</td><td>Dako</td><td>Z0311</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 przeciwkrólicze IgG kozie</td><td>Invitrogen</td><td>A-11036</td><td>rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>YO-PRO-1</td><td>Invitrogen</td><td>Y3603</td><td></td></tr><tr><td>smar próżniowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>S41718</td><td></td></tr><tr><td>Żel Affi-Gel Blue</td><td>Bio-Rad</td><td>153-7301</td><td></td></tr></tbody></table>

krojenie w wibratomie w celu lepszego zachowania cytoarchitektury organu cortiego ssaków

Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

Ssaczy organ Cortiego stanowi ściśle uporządkowaną komórkową mozaikę mechanosensorycznych komórek rzęskowych oraz niesensorycznych komórek podporowych (przegląd w 1,2). Wizualizacja tej komórkowej mozaiki często wymaga wykonania przekroju poprzecznego organu Cortiego. W szczególności niesensoryczne komórki filarowe i komórki Deitera, których jądra znajdują się bazalnie względem komórek rzęskowych, nie mogą być zwizualizowane bez przeprowadzenia przekroju poprzecznego organu Cortiego. Jednakże delikatna cytoarchitektura ssaczego organu Cortiego, w tym cienkie wypustki cytoplazmatyczne komórek filarowych i komórek Deitera, jest trudna do zachowania przy użyciu rutynowych procedur histologicznych, takich jak sekcjonowanie w parafinie i kriotomia, które są kompatybilne ze standardowymi technikami barwienia immunohistochemicznego.
W niniejszym opracowaniu opisuję prostą i niezawodną procedurę składającą się z cięcia ślimaka w wibratomie, barwienia immunohistochemicznego tych przekrojów w preparatach całych (whole mount), a następnie zastosowania mikroskopii konfokalnej. Procedura ta była szeroko stosowana do analiz immunohistochemicznych wielu organów, w tym pąków kończyn myszy, jelit danio pręgowanego, wątroby, trzustki i serca (wybrane przykłady w 3-6). Ponadto procedura ta okazała się skuteczna zarówno w obrazowaniu, jak i w kwantyfikacji liczby komórek filarowych w mutacyjnych i kontrolnych narządach Cortiego u zarodków oraz dorosłych myszy 7. Metoda ta nie jest jednak obecnie powszechnie stosowana do badania ssaczego narządu Cortiego. Opisano potencjał tej procedury w zakresie lepszego zachowania subtelnej cytoarchitektury dorosłego narządu Cortiego oraz możliwości kwantyfikacji różnych typów komórek.

Opisano prostą procedurę krojenia narządu Cortiego za pomocą wibratomu, a następnie przeprowadzenia immunohistochemii i mikroskopii konfokalnej. Procedura ta pozwala na lepsze zachowanie drobnej cytoarchitektury narządu Cortiego u ssaków, a w konsekwencji umożliwia dokładną kwantyfikację typów komórek.

Krojenie w wibratomie w celu lepszego zachowania cytoarchitektury organu Cortiego ssaków

Ssaczy organ Cortiego stanowi wysoce uporządkowaną komórkową mozaikę mechanosensorycznych komórek rzęsatych oraz niesensorycznych komórek podporowych (przegląd w 1,2). Wizualizacja ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest obrazowanie narządu Cortiego z maksymalnym zachowaniem architektury komórkowej. Osiąga się to poprzez przecinanie wypreparowanych i utrwalonych ucha wewnętrznych za pomocą wibrotomu w celu uzyskania grubych przekrojów przy jednoczesnej minimalizacji liczby powierzchni cięcia na ślimaka. Przekroje z wibrotomu są następnie barwione metodą immunohistochemiczną, co pozwala na identyfikację różnych typów komórek i struktur komórkowych w narządzie Cortiego.Następnie przekroje są montowane i obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości, które definiują pozycje Z. W każdym grubym przekroju Vibram uzyskuje się wyniki umożliwiające obrazowanie konfokalne komórek i struktur w ślimaka (organum spirale) przy minimalnych zakłóceniach spowodowanych procesem sekcjonowania. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak sekcjonowanie w parafinie i kriosekcjonowanie, jest zminimalizowanie uszkodzeń fizycznych ślimaka, co pozwala na lepsze zachowanie architektury komórkowej organum spirale. Aby wyizolować ucho wewnętrzne, najpierw należy przeprowadzić dekapitację uśpionej dorosłej myszy za pomocą żyletki.Otwórz czaszkę wzdłuż linii środkowej, a następnie ostrożnie usuń mózg za pomocą pęsety, aby odsłonić oba uszy, i delikatnie je wyłuskaj. Zanurz uszy wewnętrzne w probówce kriogenicznej zawierającej świeży 4% paraformaldehyd i delikatnie kołysz przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia wypłucz utrwalacz trzykrotnie w jednokrotnym roztworze soli fizjologicznej PBS, a następnie odwapnij tkankę dorosłego osobnika poprzez inkubację w 10% EDTA w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć dni.Przepłukać i przechowywać wewnętrzne ucha w 1× PBS do momentu rozpoczęcia przetwarzania. Przygotować 4% niskotopiący agar, dodając agar do 1× PBS i podgrzewając w kuchence mikrofalowej do całkowitego rozpuszczenia. Utrzymywać roztopiony agar w kąpieli wodnej o temperaturze 55 °C do momentu użycia.Usunąć ucho wewnętrzne z PBS za pomocą pęsety i umieścić je na dnie formy do zatapiania z odrywanym dnem. Odessać pipetą pozostały płyn, a następnie całkowicie wypełnić formę mol-arosem, tak aby ucho wewnętrzne było w całości zakryte, w celu wykonania przekrojów poprzecznych przez organ Cortiego. Ułożyć ucho wewnętrzne tak, aby było widoczne z boku, z uwzględnieniem bocznego kanału półkolistego.Ustaw kąt widoczności ucha wewnętrznego tak, aby linia wyznaczona przez najbardziej tylny region ślimaka znajdowała się pod kątem 45 stopni względem zamierzonej płaszczyzny cięcia. Po zestaleniu agaru usuń plastikową formę. Używając żyletki, odetnij nadmiar agaru i uformuj sześcian.Należy upewnić się, że wokół tkanki pozostawiono wystarczającą ilość agaru, aby była ona odpowiednio wsparta. Podczas krojenia przymocuj podstawę kostki agarowej do powierzchni tnącej wibrotomu za pomocą superkleju, wykonaj skrawki o grubości od 40 do 100 µm i zbierz plastry do naczynia z 1× PBS z dodatkiem 0,1% Triton X 100, używając pęsety.Oddziel preparaty od podłoża. Przenieś sekcje do naczynia zawierającego świeży 1x PBS z 0,1% Triton X 100, używając końcówki do pipety o szerokim otworze, a następnie przeprowadź barwienie przeciwciałami w płytce do hodowli tkankowej. Po zakończeniu barwienia przeciwciałami sekcje tkanek należy zamontować na szkiełku mikroskopowym.Aby zapobiec zgniataniu grubych skrawków tkanki, nałóż warstwę smaru próżniowego w kwadrat wokół skrawka, aby stworzyć przestrzeń między szkiełkiem podstawnym a nakrywką. Przenieś skrawki tkanki na szkiełko mikroskopowe. Mocno dociśnij krawędzie nakrywki, aby zapewnić szczelność.Alternatywnie, nanieś pipetą 1 µL żywicy do chromatografii agarozowej o znanej wielkości oczek w każdy z czterech rogów, w których spocznie szkiełko nakrywkowe, połóż szkiełko nakrywkowe i uszczelnij krawędzie lakierem do paznokci przed obrazowaniem. Na pierwszym obrazie z serii confocal z-stack przez przekrój organu Cortiego widoczne są wewnętrzne komórki rzęskowe, sąsiednie wewnętrzne komórki rzęskowe, zewnętrzne komórki rzęskowe oraz komórki Deitersa. Przy barwieniu jąder komórkowych komórki filarowe są widoczne dzięki barwieniu przeciwciałem S100 i mają kolor żółty. W miarę jak z-stack postępuje przez przekrój w krokach co 3 µm, liczbę komórek filarowych można zliczyć, odnotowując pojawianie się i znikanie ich jąder.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wykonywać skrawki ucha wewnętrznego za pomocą wibrotomu, przeprowadzać immunohistochemię na tych skrawkach, a następnie obrazować je za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ta prosta procedura, którą można zastosować do dowolnego przeciwciała, zapewnia maksymalne zachowanie organizacji komórkowej organu Cortiego.

vibratome-sectioning-for-enhanced-preservation-cytoarchitecture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Cięcie wibratomem w celu poprawy zachowania cytoarchitektury ssaka narządu Cortiego

Niniejsza procedura opisuje metodę izolacji i hodowli mysiego narządu Cortiego z lub bez listka spiralnego i neuronów zwoju spiralnego. Prezentujemy również metodę ekspresji egzogennego genu reporterowego w eksplantacie narządu Cortiego za pomocą elektroporacji.

Kultura pierwotna i elektroporacja plazmidowa mysiego narządu Cortiego.

Niniejszy protokół opisuje test z wykorzystaniem organotypowych przekrojów zoptymalizowany dla mózgu postnatalnego oraz wysokorozdzielcze obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w rostralnym prądzie migracyjnym.

Organotypowy test skrawkowy do wysokorozdzielczego obrazowania poklatkowego migracji neuronalnej w mózgu postnatalnym

Opisujemy procedury przygotowania oraz rejestracji elektrofizjologicznej z plastrów mózgu, które zachowują oś grzbietowo-brzuszną przyśrodkowej kory entorynalnej (MEC). Ponieważ neuronalne kodowanie lokalizacji wykazuje organizację grzbietowo-brzuszną w obrębie MEC, procedury te ułatwiają badanie mechanizmów komórkowych istotnych dla nawigacji i pamięci.

Przygotowanie przekrojów parasagitalnych do badania organizacji grzbietowo-brzusznej przyśrodkowej kory entorynalnej gryzoni

W tym filmie pokazujemy wibratom przekroju całej nerki myszy w celu uzyskania cienkich plasterków. Te pokrojone skrawki tkanki mogą być przechowywane w niskich temperaturach do czasu dalszej analizy.

Przekroje wibratomowe całej mysiej nerki: technika generowania cienkich odcinków mysiej nerki

Ten film przedstawia izolację mysiego narządu lemieszowo-nosowego (VNO) i przygotowanie tkanek do cięcia wibratomem. Sekcje służą do scharakteryzowania biofizycznych i fizjologicznych atrybutów określonej grupy neuronów czuciowych.

Przygotowanie mysiego narządu lemieszowo-nosowego do przekroju wibratomu

Siatkówka nerwowa myszy w wieku 8 dni znajduje się na 4% bloku żelatyny. Po wyizolowaniu warstwy fotoreceptorów (200 μm) za pomocą wibratomu, fotoreceptory są wysiewane po dysocjacji mechanicznej i enzymatycznej do hodowli. Warstwa fotoreceptorowa może być wykorzystana do analiz molekularnych, biochemicznych lub transplantacji.

Cięcie wibratomem siatkówki myszy w celu przygotowania kultur fotoreceptorowych

Przedstawiamy metodę izolowania dorosłego organu Cortiego jako trzech nienaruszonych zwojów ślimaka (wierzchołek, środek i podstawa). Demonstrujemy również procedurę barwienia immunologicznego za pomocą fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał. Razem techniki te pozwalają na badanie komórek rzęsatych, komórek podporowych i innych typów komórek znajdujących się w ślimaku.

Rozwarstwienie całej góry i immunofluorescencja ślimaka dorosłej myszy

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię uzyskiwania spłaszczonych przekrojów stycznych z kory mózgowej ssaków i wizualizacji modułów korowych za pomocą metod histochemicznych i immunohistochemicznych.

Wizualizacja modułów korowych w spłaszczonych korach ssaków

Ten manuskrypt opisuje eksperymentalny protokół oceny cech morfologicznych i statusu funkcjonalnego synaps wstęgowych u normalnych myszy. Prezentowany model nadaje się również do modeli z ograniczeniami synaptopatii ślimakowej wywołanych hałasem i związanych z wiekiem. Omówiono również korelacyjne wyniki poprzednich badań na myszach.

Ocena morfologiczna i funkcjonalna synaps wstęgowych w określonych obszarach częstości ślimaka myszy

W tym badaniu prezentujemy metodę obrazowania w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii konfokalnej do obserwacji komórek poruszających się w kierunku uszkodzonej tkanki poprzez inkubację ex vivo z nabłonkiem ślimaka zawierającym narząd Cortiego.

Obrazowanie poklatkowe żywych komórek in vitro w celu zbadania migracji komórek w kierunku narządu Cortiego

Tutaj dostępny jest zoptymalizowany protokół krok po kroku do utrwalania, barwienia immunologicznego i sekcji zarodków w celu wykrycia wyspecjalizowanych filopodiów sygnałowych zwanych cytonemami w rozwijających się tkankach myszy.

Utrwalanie zarodkowej tkanki myszy do analizy cytonemu

Poznaj metodę sekcji wibratomowej narządu Corti ssaków z zachowaniem cytoarchitektury komórkowej. Technika umożliwia immunohistochemiczne barwienie i wysokorozdzielczą mikroskopię konfokalową do precyzyjnej identyfikacji typów komórek.

Krojenie w wibratomie w celu lepszego zachowania cytoarchitektury organu Cortiego ssaków

Przeglądaj więcej filmów