Krojenie w wibratomie w celu lepszego zachowania cytoarchitektury organu Cortiego ssaków

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest obrazowanie narządu Cortiego z maksymalnym zachowaniem architektury komórkowej. Osiąga się to poprzez przecinanie wypreparowanych i utrwalonych ucha wewnętrznych za pomocą wibrotomu w celu uzyskania grubych przekrojów przy jednoczesnej minimalizacji liczby powierzchni cięcia na ślimaka. Przekroje z wibrotomu są następnie barwione metodą immunohistochemiczną, co pozwala na identyfikację różnych typów komórek i struktur komórkowych w narządzie Cortiego.

Następnie przekroje są montowane i obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości, które definiują pozycje Z. W każdym grubym przekroju Vibram uzyskuje się wyniki umożliwiające obrazowanie konfokalne komórek i struktur w ślimaka (organum spirale) przy minimalnych zakłóceniach spowodowanych procesem sekcjonowania. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak sekcjonowanie w parafinie i kriosekcjonowanie, jest zminimalizowanie uszkodzeń fizycznych ślimaka, co pozwala na lepsze zachowanie architektury komórkowej organum spirale. Aby wyizolować ucho wewnętrzne, najpierw należy przeprowadzić dekapitację uśpionej dorosłej myszy za pomocą żyletki.

Otwórz czaszkę wzdłuż linii środkowej, a następnie ostrożnie usuń mózg za pomocą pęsety, aby odsłonić oba uszy, i delikatnie je wyłuskaj. Zanurz uszy wewnętrzne w probówce kriogenicznej zawierającej świeży 4% paraformaldehyd i delikatnie kołysz przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia wypłucz utrwalacz trzykrotnie w jednokrotnym roztworze soli fizjologicznej PBS, a następnie odwapnij tkankę dorosłego osobnika poprzez inkubację w 10% EDTA w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć dni.

Przepłukać i przechowywać wewnętrzne ucha w 1× PBS do momentu rozpoczęcia przetwarzania. Przygotować 4% niskotopiący agar, dodając agar do 1× PBS i podgrzewając w kuchence mikrofalowej do całkowitego rozpuszczenia. Utrzymywać roztopiony agar w kąpieli wodnej o temperaturze 55 °C do momentu użycia.

Usunąć ucho wewnętrzne z PBS za pomocą pęsety i umieścić je na dnie formy do zatapiania z odrywanym dnem. Odessać pipetą pozostały płyn, a następnie całkowicie wypełnić formę mol-arosem, tak aby ucho wewnętrzne było w całości zakryte, w celu wykonania przekrojów poprzecznych przez organ Cortiego. Ułożyć ucho wewnętrzne tak, aby było widoczne z boku, z uwzględnieniem bocznego kanału półkolistego.

Ustaw kąt widoczności ucha wewnętrznego tak, aby linia wyznaczona przez najbardziej tylny region ślimaka znajdowała się pod kątem 45 stopni względem zamierzonej płaszczyzny cięcia. Po zestaleniu agaru usuń plastikową formę. Używając żyletki, odetnij nadmiar agaru i uformuj sześcian.

Należy upewnić się, że wokół tkanki pozostawiono wystarczającą ilość agaru, aby była ona odpowiednio wsparta. Podczas krojenia przymocuj podstawę kostki agarowej do powierzchni tnącej wibrotomu za pomocą superkleju, wykonaj skrawki o grubości od 40 do 100 µm i zbierz plastry do naczynia z 1× PBS z dodatkiem 0,1% Triton X 100, używając pęsety.

Oddziel preparaty od podłoża. Przenieś sekcje do naczynia zawierającego świeży 1x PBS z 0,1% Triton X 100, używając końcówki do pipety o szerokim otworze, a następnie przeprowadź barwienie przeciwciałami w płytce do hodowli tkankowej. Po zakończeniu barwienia przeciwciałami sekcje tkanek należy zamontować na szkiełku mikroskopowym.

Aby zapobiec zgniataniu grubych skrawków tkanki, nałóż warstwę smaru próżniowego w kwadrat wokół skrawka, aby stworzyć przestrzeń między szkiełkiem podstawnym a nakrywką. Przenieś skrawki tkanki na szkiełko mikroskopowe. Mocno dociśnij krawędzie nakrywki, aby zapewnić szczelność.

Alternatywnie, nanieś pipetą 1 µL żywicy do chromatografii agarozowej o znanej wielkości oczek w każdy z czterech rogów, w których spocznie szkiełko nakrywkowe, połóż szkiełko nakrywkowe i uszczelnij krawędzie lakierem do paznokci przed obrazowaniem. Na pierwszym obrazie z serii confocal z-stack przez przekrój organu Cortiego widoczne są wewnętrzne komórki rzęskowe, sąsiednie wewnętrzne komórki rzęskowe, zewnętrzne komórki rzęskowe oraz komórki Deitersa. Przy barwieniu jąder komórkowych komórki filarowe są widoczne dzięki barwieniu przeciwciałem S100 i mają kolor żółty. W miarę jak z-stack postępuje przez przekrój w krokach co 3 µm, liczbę komórek filarowych można zliczyć, odnotowując pojawianie się i znikanie ich jąder.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wykonywać skrawki ucha wewnętrznego za pomocą wibrotomu, przeprowadzać immunohistochemię na tych skrawkach, a następnie obrazować je za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ta prosta procedura, którą można zastosować do dowolnego przeciwciała, zapewnia maksymalne zachowanie organizacji komórkowej organu Cortiego.