Name: Kalorymetria miareczkowa izotermiczna do pomiaru powinowactwa makrocząsteczk-ligand (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Poznaj kalorymetrię miareczkową izotermiczną do badania wiązań ligand-makrocząsteczka. Ta metoda pozwala wyznaczyć entalpię i entropię wiązania w jednym eksperymencie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant NSF nr MCB-0817827.

Izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC) jest uznaną techniką, która pozwala na określenie wszystkich parametrów termodynamicznych (powinowactwa, entalpii i stechiometrii) oddziaływania wiążącego w ramach jednego eksperymentu.1 Metoda ITC polega na miareczkowaniu jednego reagenta drugim w warunkach izotermicznych. Mierzonym sygnałem jest ciepło wydzielane lub pochłaniane podczas oddziaływania (wiązania) dwóch reagentów. Wykonuje się serię wtrysków, a sygnał cieplny dąży do zera w miarę nasycenia reagenta ograniczającego. Dopasowanie izotermy pozwala na wyznaczenie parametrów termodynamicznych. Dostępnych jest kilka opracowań przeglądowych opisujących zarówno instrumentarium, jak i matematyczne podstawy gromadzenia i analizy danych. 2,3 Choć dostępne są inne kalorymetry (w szczególności ITC200 do pracy z małymi objętościami), w niniejszym materiale opisujemy ogólny protokół dla urządzenia VP-ITC produkowanego przez MicroCal (obecnie część GE Healthcare).
1. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Aby przygotować makrocząsteczkę i ligand w buforze, należy rozwiązać kilka potencjalnych problemów. Precyzyjne dopasowanie danych wymaga odpowiednich stężeń makrocząsteczki (substancji, która zazwyczaj znajduje się w komórce pomiarowej ITC) oraz ligandu (substancji w strzykawce dozującej). Ponieważ niektóre białka ulegają agregacji przy wysokich stężeniach wymaganych dla substancji w strzykawce dozującej, białko najczęściej ładuje się do komórki pomiarowej. Optymalne stężenie makrocząsteczki wyznacza się na podstawie wartości „c”, będącej iloczynem przewidywanego powinowactwa układu (które można oszacować metodami ortogonalnymi przed zastosowaniem ITC) i całkowitego stężenia makrocząsteczki, gdzie c = Ka*[M]. Optymalne wartości c mieszczą się w zakresie 10-1000,1 choć w określonych warunkach eksperymentalnych możliwe jest uzyskanie dokładnych danych dla układów o słabym wiązaniu przy wartościach c poniżej dolnej granicy.4 Zatem stężenie makrocząsteczki musi zostać określone z uwzględnieniem tego zakresu wartości c (np. dla Ka wynoszącego 106 M-1 należy zastosować stężenia makrocząsteczki od 10 do 1000 μM). Wcześniejsza wiedza o powinowactwie wiązania w układzie może pomóc zminimalizować ilość białka zużytego do ITC dzięki lepszemu zaprojektowaniu eksperymentu. Stężenie ligandu powinno być wystarczająco wysokie (7-25 razy większe niż Kd dla najsłabiej wiążącego miejsca ligandu), aby nasycenie nastąpiło w obrębie pierwszej jednej trzeciej lub połowy miareczkowania. Precyzyjne dopasowanie danych wymaga również nasycenia sygnału. W przypadku układów o wyższym powinowactwie wiązania należy zastosować niższe stężenie ligandu, aby uniknąć zbyt wczesnego nasycenia podczas miareczkowania, co prowadziłoby do niedokładnego dopasowania. Po odjęciu od miareczkowania kontroli ciepła rozcieńczenia (tj. miareczkowania ligandu do buforu), entalpia przy nasyceniu powinna dążyć do zera.</li>
	<li>Ponieważ zanieczyszczenia małymi cząsteczkami mogą powodować sygnały artefaktowe w pomiarach ITC, najlepiej jest, jeśli to możliwe, przeprowadzić wyczerpującą dializę makrocząsteczki i ligandu przeciwko buforowi. Alternatywnie, w celu zmiany buforu makrocząsteczki można zastosować chromatografię kolumnową, odsolone kolumny spinowe lub wirówkowe filtry do wymiany buforu (na przykład Centricony). Jeśli ligandem jest mała cząsteczka, można go przygotować za pomocą buforu do dializy po tym, jak makrocząsteczka została zdializowana, lub poprzez dializę przeciwko membranom o odcięciu odpowiednim dla małych cząsteczek (np. 100-500 Da dla Spectra/Por Float-A-Lyzer). Różnice w składzie buforu pomiędzy roztworami ligandu i makrocząsteczki mogą prowadzić do artefaktów sygnału wynikających z ciepła rozcieńczenia zanieczyszczeń w próbkach. Po przygotowaniu należy sprawdzić, czy pH buforu, makrocząsteczki i ligandu są zgodne (± 0,05 jednostki pH), ponieważ efekty protonowania buforu mogą wywoływać artefakty w entalpii.5 Należy upewnić się, że przygotowano wystarczającą ilość każdej substancji. Dla eksperymentów w trzech powtórzeniach oraz kontroli rozcieńczenia ilość potrzebnego materiału będzie zależeć od użytego urządzenia ITC. Jednak dla większości instrumentów ITC, które posiadają komórki pomiarowe o objętości około 2 ml, konieczne będzie co najmniej 6-7 ml roztworu makrocząsteczki, który można wygodnie przygotować w probówkach typu falcon 15 ml. W przypadku strzykawek dozujących o objętości 300 μL wystarczające powinno być 1-2 ml roztworu, który można przygotować w probówkach typu falcon lub probówkach do mikrocentryfugi.</li>
	<li>Kurz i inne cząsteczki mogą powodować artefakty w linii bazowej termogramu ITC. Jest niezbędne, aby zostały one usunięte przed rozpoczęciem eksperymentu. Po przygotowaniu roztworów zapasowych próbek należy je wirować w probówkach do mikrocentryfugi przez pięć minut przy 8000 do 14 000 RPM, aby wytrącić cząsteczki w roztworze. Należy zebrać nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu, i przelać go do nowej probówki typu falcon/mikrocentryfuga. 
	Jeśli do utrzymania zredukowanych cystein niezbędne są reduktory, należy stosować niskie stężenia i świeże roztwory zapasowe β-merkaptoetanolu, TCEP (tris(2-karboksy)fosfiny) lub ditiotreitolu, aby zminimalizować artefakty wynikające z utleniania reduktora. Ponadto obecność rozpuszczalników organicznych w buforze (częsta w przypadku niektórych ligandów będących małymi cząsteczkami, które mogą wymagać metanolu lub DMSO w celu rozpuszczenia) może powodować artefakty sygnału. Jeśli do ligandu niezbędne są rozpuszczalniki organiczne, roztwór makrocząsteczki musi również zawierać takie samo stężenie, aby uniknąć sygnałów wynikających z ciepła rozcieńczenia rozpuszczalnika organicznego. Podczas przygotowania próbek możliwe są niewielkie różnice w składzie buforu między ligandem a makrocząsteczką ze względu na cosolwenty, sole lub pH. Najlepiej jest sprawdzić rozcieńczenie ligandu w buforze pomiarowym lub buforu pomiarowego w makrocząsteczce, aby upewnić się, że sygnały cieplne wynikające z różnic w zawartości buforu nie generują danych będących wyłącznie artefaktami.</li>
	<li>Należy dokładnie sprawdzić stężenia makrocząsteczki i ligandu, korzystając z technik odpowiednich dla danego układu (takich jak pomiary absorbancji, HPLC, testy kolorymetryczne, testy BCA dla białek itp.), aby odnotować ich dokładne wartości. Różnice między rzeczywistym stężeniem a stężeniem użytym do dopasowania izotermy spowodują błędy w stechiometrii, entalpii i powinowactwie wiązania wyznaczonym z eksperymentu. Powszechną praktyką jest odgazowanie próbek, aby uniknąć artefaktów sygnału spowodowanych pęcherzykami powietrza lub uwalnianiem rozpuszczonych gazów podczas miareczkowania, szczególnie w wyższych temperaturach.</li>
</ol>
2. Przygotowanie eksperymentu
<ol>
	<li>Upewnij się, że ogniwo z próbką i strzykawka do iniekcji zostały oczyszczone zgodnie z protokołem producenta przed załadowaniem makrocząsteczki i liganda. Przepłucz ogniwo z próbką dwa lub trzy razy 1,8 ml wody destylowanej za pomocą strzykawki Hamiltona (zachowaj ostrożność przy obsłudze strzykawki Hamiltona, ponieważ tłok jest łatwo łamliwy, a igła podatna na wygięcie). Następnie kilkukrotnie przepłucz ogniwo z próbką 1,8 ml buforu. Napełnij ogniwo z próbką 1,8 ml roztworu makrocząsteczki, uważając, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Napełnij ogniwo referencyjne wodą destylowaną. W przypadku większości buforów woda destylowana nadaje się jako roztwór referencyjny. Jednak w przypadku buforów o szczególnie wysokiej sile jonowej lub osmolalności lepiej jest zastosować bufor jako referencję.</li>
	<li>Usuń pęcherzyki powietrza z ogniw referencyjnego i z próbką za pomocą strzykawki Hamiltona. Delikatnie przesuwaj igłę strzykawki w górę i w dół wzdłuż ścianek ogniwa, spychając wszelkie pęcherzyki, które mogą znajdować się na dnie ogniwa i przylegać do wgłębienia, ku górze ogniwa. Usuń nadmiar objętości z ogniwa z próbką i ogniwa referencyjnego.</li>
	<li>Podłącz plastikową strzykawkę do portu napełniania strzykawki do iniekcji za pomocą drenu. Przepłucz strzykawkę do iniekcji wodą destylowaną, a następnie buforem. Upewnij się, że strzykawka do iniekcji jest całkowicie opróżniona poprzez zassanie powietrza przez system. Umieść igłę strzykawki do iniekcji w roztworze liganda i pobierz go do strzykawki, aż zostanie ona całkowicie wypełniona. Pobierz niewielką nadmiarową objętość (około 50 μl lub więcej) do portu i podłączonego drenu. Natychmiast zamknij port napełniania strzykawki i odłącz dren oraz plastikową strzykawkę. Opróżnij i ponownie napełnij strzykawkę do iniekcji jeszcze dwa razy, aby usunąć z niej wszelkie pęcherzyki powietrza. Wyjmij strzykawkę z roztworu liganda i przetrzyj jej bok chusteczką kimwipe, aby usunąć krople, uważając, by nie dotknąć końcówki strzykawki chusteczką, ponieważ może to spowodować utratę objętości ze strzykawki. Należy również uważać, aby nie uderzyć ani nie potrząsnąć strzykawką, gdyż może to również spowodować utratę objętości z końcówki strzykawki. Umieść strzykawkę do iniekcji w ogniwie z próbką.</li>
	<li>Ustaw parametry prowadzenia pomiaru ITC. Dla układów wiązania z silnymi sygnałami cieplnymi duża liczba iniekcji małych objętości dostarczy więcej punktów danych do dopasowania (np. 75 iniekcji po 3 μl). Dla układów o słabych sygnałach cieplnych preferowana jest mała liczba iniekcji dużych objętości (np. 33 iniekcje po 8 μl). Najczęściej stosuje się mniejszą liczbę iniekcji o większych objętościach. Optymalizacja warunków najlepiej dopasowanych do danego układu może wymagać przeprowadzenia kilku miarek. Ważne jest, aby zauważyć, że entalpia wiązania może być egzotermiczna lub endotermiczna, w zależności od badanego układu. Niestety niektóre układy wykazują słabe sygnały cieplne, co utrudnia określenie ciepła reakcji. Problemy w takich układach można potencjalnie rozwiązać poprzez zwiększenie stężenia makrocząsteczki, zmianę temperatury eksperymentu (w zależności od pojemności cieplnej układu wiązania) i/lub zmianę pH lub siły jonowej buforu.</li>
	<li>Należy również rozważyć odstępy czasowe między poszczególnymi iniekcjami. Jest niezbędne, aby po każdej iniekcji liganda system miał czas na wyrównanie, a sygnał cieplny powrócił do linii bazowej przed kolejną iniekcją. Dla większości układów od trzech do pięciu minut powinno być wystarczające. Czas między iniekcjami należy zwiększyć w przypadku układów, w których wyrównanie nie następuje w ciągu pięciu minut.</li>
	<li>Ponieważ po włożeniu strzykawki do iniekcji do ogniwa z próbką nastąpi pewne mieszanie roztworów makrocząsteczki i liganda w strzykawce, pierwsza iniekcja da błędne wyniki. Najlepiej jest zastosować małe objętości (np. 2 μl) dla pierwszej lub drugiej iniekcji (aby można było je później odrzucić), a kolejne iniekcje utrzymać na pożądanych wartościach.</li>
	<li>Wybierz temperaturę eksperymentu (najczęściej jest to 25 °C, choć można stosować temperatury od 2 do 80 °C). Najlepiej wybrać temperaturę zgodną z innymi eksperymentami (wiązania, kinetyki itp.) przeprowadzonymi dla układu ligand-makrocząsteczka. ITC można ustawić tak, aby wyrównywało się w temperaturze innej niż temperatura eksperymentu. Jeśli eksperyment ma być przeprowadzony w temperaturze oddalonej od temperatury pokojowej o więcej niż 10 °C, najlepiej ustawić temperaturę wyrównywania instrumentu w granicach 5 °C od temperatury eksperymentalnej. Skróci to czas potrzebny instrumentowi na osiągnięcie temperatury eksperymentu. 
	Należy również rozważyć prędkość mieszania strzykawki. Mieszanie jest niezbędne do odpowiedniego zmieszania liganda i makrocząsteczki podczas miareczkowania, ale niektóre białka ulegają destabilizacji przy szybkim mieszaniu. W takich przypadkach prędkość mieszania powinna być ustawiona na stosunkowo niskim poziomie. Po ustawieniu wszystkich parametrów eksperymentalnych można rozpocząć pomiar.</li>
	<li>Po zakończeniu eksperymentu ITC można oczyścić zgodnie z protokołem producenta. Roztwór w ogniwie z próbką po zakończeniu pomiaru można zachować, jeśli planowane są dodatkowe eksperymenty na mieszaninie kompleksu makrocząsteczka-ligand.</li>
	<li>Powtórz miareczkowania co najmniej jeden lub dwa razy, aby uzyskać powtarzalne dane. Przeprowadź pomiar kontrolny, w którym ligand jest miareczkowany do buforu w ogniwie z próbką, aby określić ciepło rozcieńczenia liganda. Dla niektórych układów, w których występuje wiązanie kooperatywne, dodatkowych informacji o procesie wiązania można uzyskać poprzez iniekcję makrocząsteczki do liganda. Różne orientacje iniekcji mogą dostarczyć dodatkowych informacji, które mogą być pomocne przy dopasowaniu globalnym.6</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
	<li>Dopasowanie danych można łatwo przeprowadzić za pomocą makr w dowolnym programie do dopasowywania danych (zazwyczaj dostarczanym przez producenta wraz z instrumentem). Wczytaj pierwszy plik danych. Sprawdź surowy termogram pod kątem pęcherzyków powietrza lub innych artefaktów w sygnale. Jeśli występują jakiekolwiek artefakty (takie jak skoki linii bazowej lub piki w momentach, w których nie nastąpił wtrysk), należy odnotować te punkty danych, ponieważ powinny one zostać usunięte. Następnie wczytaj dane kontrolne dla rozcieńczenia ligandu i odejmij dane rozcieńczenia ligandu od izotermy wiązania. W tym momencie usuń wszystkie błędne punkty danych, w tym jeden lub dwa pierwsze punkty miareczkowania, w których występują artefakty rozcieńczenia (patrz krok 7).</li>
	<li>Wybierz model dopasowania danych (jedno miejsce wiązania, dwa/wiele miejsc wiązania, wiązanie kooperacyjne itp.), który zostanie użyty do dopasowania danych. Dane można dopasować, wprowadzając wartości początkowe parametrów dopasowania: stechiometrię (n), entalpię (ΔH) oraz powinowactwo wiązania (Ka). Jeśli z eksperymentów ortogonalnych znane jest uprzednio powinowactwo wiązania lub inne parametry, można wprowadzić te wartości. Pomaga to uniknąć utknięcia procesu dopasowania w minimach lokalnych. Po dopasowaniu danych dla pierwszego miareczkowania powtórz kroki 15 i 16 dla pozostałych izoterm. Alternatywnie dane można dopasować globalnie, korzystając z programów takich jak SEDPHAT.6 SEDPHAT może być szczególnie pomocny przy globalnym dopasowywaniu zestawów danych kompleksów binarnych (tj. cząsteczek A+B) w połączeniu z zestawami danych kompleksów ternarnych (cząsteczki A+B+C). Na przykład w przypadku wiązania cząsteczki C do kompleksu A-B nie zawsze jest jasne, czy może wystąpić sygnał wynikający z wiązania C do A lub B do A (jeśli A nie jest w pełni nasycone).</li>
	<li>Aby upewnić się, że dane ITC nie są artefaktami, powinowactwo wiązania i stechiometrie uzyskane z ITC należy porównać z metodą ortogonalną.7,8 Dodatkowo wartość entalpii z ITC można porównać z entalpią z wykresu van't Hoffa.9 Pomocne może być również zastosowanie różnych stężeń ligandu lub makrocząsteczki, ponieważ bezwzględna wartość sygnału cieplnego powinna wzrastać wraz ze wzrostem stężenia makrocząsteczki. Artefakty najczęściej pojawiają się, gdy bufory w celi i strzykawce nie są identyczne. Innym źródłem artefaktów mogą być nieczyste próbki.</li>
	<li>Zalecamy, aby użytkownik rozpoczął od prostych miareczkowań kompleksów binarnych, dla których dostępne są wcześniejsze informacje na temat Kd i stechiometrii. Następnie, jeśli wiążą się dodatkowe ligandy, użytkownik może spróbować bardziej skomplikowanych miareczkowań kompleksów ternarnych, zmieniając stężenia ligandów i ewentualnie zamieniając składniki w strzykawce i celi. Porównanie entalpii dla obu ścieżek tworzenia kompleksu ternarnego powinno być addytywne, ponieważ entalpia jest funkcją stanu.10 Tutaj również program SEDPHAT6 może okazać się bardzo użyteczny.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
<img alt="Dane z izotermicznej kalorymetrii miareczkowej; wykresy ΔP w funkcji czasu oraz ΔH w funkcji [NADPH]/[EcDHFR] wraz z rezyduami." src="/files/ftp_upload/2796/2796fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Reprezentatywny przykład prawidłowego miareczkowania dla wiązania kofaktora NADPH z chromosomalną reduktazą dihydrofolianową E. coli (ecDHFR). Panel (A) przedstawia surowy termogram; (B) izotermę wiązania uzyskaną z dopasowania zintegrowanego termogramu z wykorzystaniem modelu jednego miejsca w oprogramowaniu Origin; oraz (C) dopasowanie izotermy z wykorzystaniem modelu jednego miejsca wiązania z programu SEDPHAT wraz z rezyduami dopasowania. Z oprogramowania Origin, przy użyciu modelu wiązania jednego miejsca, uzyskano: n = 1.09 ± 0.02, Kd = 0.194 ± 0.001 μM, ΔH = -22.7 ± 0.4 kcal/mol, TΔS = -13.1 ± 0.4 kcal/mol oraz ΔG = -9.16 ± 0.01 kcal/mol. Dopasowania danych za pomocą programu Sedphat dały wartości: n = 0.94 ± 0.01, Kd = 0.195 ± 0.013 ΔM, ΔH = -22.5 ± 0.2 kcal/mol, TΔS = -13.39 kcal / mol oraz ΔG = -9.15 kcal/mol.

<ol><li>Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+binding+constants+and+heats+of+binding+using+a+new+titration+calorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter.</a> Anal. Biochem. 179, 131-137 (1989).</li>
<li>Jelesarov, I., Bosshard, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+and+differential+scanning+calorimetry+as+complementary+tools+to+investigate+the+energetics+of+biomolecular+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry and differential scanning calorimetry as complementary tools to investigate the energetics of biomolecular recognition.</a> J. Mol. Recognit. 12, 3-18 (1999).</li>
<li>Velazquez-Campoy, A., Leavitt, S. A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+protein-protein+interactions+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of protein-protein interactions by isothermal titration calorimetry.</a> Methods Mol. Biol. 261, 35-54 (2004).</li>
<li>Turnbull, W. B., Daranas, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+value+of+c%3A+can+low+affinity+systems+be+studied+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">On the value of c: can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 14859-14866 (2003).</li>
<li>Fukada, H., Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enthalpy+and+heat+capacity+changes+for+the+proton+dissociation+of+various+buffer+components+in+0.1+M+potassium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Enthalpy and heat capacity changes for the proton dissociation of various buffer components in 0.1 M potassium chloride.</a> Proteins. 33, 159-166 (1998).</li>
<li>Houtman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+multisite+binary+and+ternary+protein+interactions+by+global+analysis+of+isothermal+titration+calorimetry+data+in+SEDPHAT%3A+application+to+adaptor+protein+complexes+in+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Studying multisite binary and ternary protein interactions by global analysis of isothermal titration calorimetry data in SEDPHAT: application to adaptor protein complexes in cell signaling.</a> Protein Sci. 16, 30-42 (2007).</li>
<li>Bradrick, T. D., Beechem, J. M., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusual+binding+stoichiometries+and+cooperativity+are+observed+during+binary+and+ternary+complex+formation+in+the+single+active+pore+of+R67+dihydrofolate+reductase%2C+a+D2+symmetric+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Unusual binding stoichiometries and cooperativity are observed during binary and ternary complex formation in the single active pore of R67 dihydrofolate reductase, a D2 symmetric protein.</a> Biochemistry. 35, 11414-11424 (1996).</li>
<li>Shenoy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+and+multivalent+binding+between+cyanovirin-N+and+branched+oligomannosides%3A+calorimetric+and+NMR+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: calorimetric and NMR characterization.</a> Chem. Biol. 9, 1109-1118 (2002).</li>
<li>Chopra, S., Lynch, R., Kim, S. H., Jackson, M., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+and+viscosity+on+R67+dihydrofolate+reductase+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature and viscosity on R67 dihydrofolate reductase catalysis.</a> Biochemistry. 45, 6596-6605 (2006).</li>
<li>Norris, A. L., Serpersu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+Coenzyme+A+with+the+Aminoglycoside+Acetyltransferase+%283%29-IIIb+and+Thermodynamics+of+a+Ternary+System%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interactions of Coenzyme A with the Aminoglycoside Acetyltransferase (3)-IIIb and Thermodynamics of a Ternary System.</a> Biochemistry. 49, 4036-4042 (2010).</li>
<li>Falconer, R. J., Penkova, A., Jelesarov, I., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+the+year+2008%3A+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Survey of the year 2008: applications of isothermal titration calorimetry.</a> J. Mol. Recognit. 23, 395-413 (2010).</li>
<li>Ababou, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+the+year+2005%3A+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> J. Mol. Recognit. 20, 4-14 (2007).</li>
<li>Buurma, N. J., Haq, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+analysis+of+isothermal+titration+calorimetry+data+for+ligand-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Advances in the analysis of isothermal titration calorimetry data for ligand-DNA interactions.</a> Methods. 42, 162-172 (2007).</li>
<li>Salim, N. N., Feig, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry of RNA.</a> Methods. 47, 198-205 (2009).</li>
<li>De, M., You, C. C., Srivastava, S., Rotello, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+interactions+of+proteins+with+functionalized+nanoparticles%3A+a+thermodynamic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Biomimetic interactions of proteins with functionalized nanoparticles: a thermodynamic study.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 10747-10753 (2007).</li>
<li>Velazquez-Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+to+determine+association+constants+for+high-affinity+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands.</a> Nat. Protoc. 1, 186-191 (2006).</li>
<li>Velazquez Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ITC+in+the+post-genomic+era...%3F+Priceless%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">ITC in the post-genomic era...? Priceless.</a> Biophys. Chem. 115, 115-124 (2005).</li>
<li>Harries, D., Rau, D. C., Parsegian, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solutes+probe+hydration+in+specific+association+of+cyclodextrin+and+adamantane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Solutes probe hydration in specific association of cyclodextrin and adamantane.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 2184-2190 (2005).</li>
<li>Chervenak, M. C., Toone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+measure+of+the+contribution+of+solvent+reorganization+to+the+enthalpy+of+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A direct measure of the contribution of solvent reorganization to the enthalpy of binding.</a> J. Am. Chem. Soc. 116, 10533-10539 (1994).</li>
<li>Taneva, S. G., Moro, F., Velazquez-Campoy, A., Muga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetics+of+nucleotide-induced+DnaK+conformational+states%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Energetics of nucleotide-induced DnaK conformational states.</a> Biochemistry. 49, 1338-1345 (2010).</li>
<li>Jelesarov, I., Bosshard, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+ferredoxin+binding+to+ferredoxin%3ANADP%2B+reductase+and+the+role+of+water+at+the+complex+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of ferredoxin binding to ferredoxin:NADP+ reductase and the role of water at the complex interface.</a> Biochemistry. 33, 13321-13328 (1994).</li>
<li>Burrows, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+monomer-dimer+equilibrium+of+interleukin-8+reveals+it+is+a+monomer+at+physiological+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of the monomer-dimer equilibrium of interleukin-8 reveals it is a monomer at physiological concentration.</a> Biochemistry. 33, 12741-12745 (1994).</li>
<li>Baker, B. M., Murphy, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+linked+protonation+effects+in+protein+binding+reactions+using+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Evaluation of linked protonation effects in protein binding reactions using isothermal titration calorimetry.</a> Biophys. J. 71, 2049-2055 (1996).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Metoda ITC była szeroko stosowana w badaniach oddziaływań ligand-makromolekuła,11 w tym w badaniach nad układami białko-ligand,12 DNA-ligand13 oraz RNA-makromolekuła.14 ITC można przeprowadzić nawet z materiałami stałymi, takimi jak nanocząstki tworzące jednorodne zawiesiny.15 Ponadto układy trójskładnikowe, w których jeden ligand jest już związany z makromolekułą, a drugi jest miareczkowany, mogą być wykorzystywane do wyznaczania termodynamiki m.in. wiązania substratu z układem enzym-kofaktor.7 Badania można również prowadzić dla cząsteczek o bardzo wysokim powinowactwie wiązania, które normalnie przekracza granicę detekcji ITC, poprzez zastosowanie testów wiązania konkurencyjnego z ligandami o słabszym wiązaniu.16 Informacje na temat słabo wiążących się ligandów można również uzyskać za pomocą analiz konkurencyjnych.17 Za pomocą ITC można badać rolę wody w wiązaniu,18 a także zależność entalpii od reorganizacji rozpuszczalnika.19 Niedawno zmierzono termodynamikę zmian konformacyjnych wariantów DNAK po związaniu ADP i ATP.20 Za pomocą ITC można badać asocjację białko-białko, uzyskując informacje na temat kompleksów hetero- 21 oraz homoasocjacji.22 Wpływ temperatury na entalpię wiązania pozwala wyznaczyć pojemność cieplną procesu wiązania.2 Liczbę protonów pochłoniętych lub wydzielonych podczas wiązania można również określić na podstawie eksperymentów przeprowadzonych w buforach o różnych entalpiach jonizacji.5 Jeśli dodatkowe badania ITC zostaną wykonane przy różnych wartościach pH, można potencjalnie wyznaczyć pKa grupy biorącej udział w procesie.23
Podsumowując, dla prawidłowego przeprowadzenia eksperymentu ITC niezbędne są dokładne pomiary stężeń makromolekuły oraz liganda. Stężenia próbek muszą być również w odpowiednim zakresie, aby uzyskać wiarygodne dane. Należy zwrócić szczególną uwagę na bufor, ponieważ zanieczyszczenia małymi cząsteczkami oraz niedopasowanie pH będą powodować artefakty na termogramie.

<table><tbody><tr><td>probówki do mikrocentryfugi 1,7 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-282</td><td></td></tr><tr><td>probówki typu Falcon 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49B</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka Hamiltona 2,5 mL</td><td>MicroCal</td><td>SYN161714</td><td></td></tr></tbody></table>

izotermiczna kalorymetria miareczkowa w pomiarach powinowactwa makrocząsteczek do ligandów

Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC) jest użytecznym narzędziem do zrozumienia pełnego obrazu termodynamicznego reakcji wiązania. W naukach biologicznych oddziaływania makromolekularne są kluczowe dla zrozumienia mechanizmów działania komórki. Warunki eksperymentalne, takie jak bufor i temperatura, mogą być dostosowane do konkretnego badanego układu wiązania. Konieczne jest jednak staranne planowanie, ponieważ uzyskanie użytecznych danych wymaga zastosowania określonych zakresów stężeń ligandu i makromolekuły. W celu uzyskania wiarygodnych wyników stężenia makromolekuły i ligandu muszą być dokładnie określone. Należy również zachować ostrożność podczas przygotowywania próbek, ponieważ zanieczyszczenia mogą znacząco wpłynąć na przebieg eksperymentu. Gdy eksperymenty ITC, wraz z odpowiednimi kontrolami, są przeprowadzone prawidłowo, uzyskuje się istotne informacje o wiązaniu, takie jak stechiometria, powinowactwo i entalpia. Poprzez wykonanie dodatkowych doświadczeń w różnych warunkach buforowych lub temperaturowych można uzyskać bardziej szczegółowe informacje o badanym układzie. Przedstawiono protokół podstawowej konfiguracji eksperymentu ITC.

Przedstawiono ogólny protokół wykorzystania izotermicznej kalorymetrii miareczkowej do monitorowania termodynamiki wiązania w układach biologicznych o umiarkowanym powinowactwie wiązania.

Izotermiczna kalorymetria miareczkowa w pomiarach powinowactwa makrocząsteczek do ligandów

Izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC) jest użytecznym narzędziem do zrozumienia pełnego obrazu termodynamicznego reakcji wiązania. W biologii...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie ogólnej techniki badania wiązania ligandu z makrocząsteczką przy użyciu izotermicznej kalorymetrii miareczkowej, czyli ITC. Jest to realizowane poprzez wstępne przygotowanie roztworów ligandu i makrocząsteczki, które są wolne od zanieczyszczeń oraz dopasowane pod względem składu buforu i pH. Następnie określane są końcowe stężenia roztworów ligandu i makrocząsteczki.Następnie ustawia się parametry eksperymentu ITC, po czym przystępuje się do zbierania danych. Ostatnim krokiem procedury jest analiza i dopasowanie danych. W rezultacie, dzięki analizie graficznej danych z miareczkowania w celu określenia parametrów wiązania i parametrów termodynamicznych, uzyskuje się wyniki obrazujące oddziaływania liganda z makrocząsteczką.Główną zaletą tej techniki wiązania w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak miareczkowanie absorpcyjne i fluorescencyjne, jest możliwość wyznaczenia entalpii, a tym samym entropii wiązania, w ramach jednego eksperymentu. Przygotowanie próbek rozpoczyna się od ustalenia odpowiednich stężeń zarówno dla makrocząsteczki, jak i liganda. Krytyczny krok w celu uzyskania dokładnych dopasowań danych ITC, zawierający informacje istotne przy obliczaniu tych stężeń, znajduje się w pisemnej procedurze.W niniejszej demonstracji badane jest wiązanie kofaktora N-A-D-P-H z enzymem dihydrofolianową reduktazą chromosomalną E. coli. Najpierw należy zrekonstytuować liofilizowaną makrocząsteczkę w buforze do pożądanego stężenia, a następnie rozpuścić ligand w odpowiedniej objętości buforu. Następnie należy sprawdzić, czy wartości pH próbek makrocząsteczki i ligandu mieszczą się w zakresie plus lub minus 0,05 jednostki pH względem buforu oraz względem siebie, a następnie odwirować oba roztwory – dihydrofolianową reduktazę chromosomalną oraz N-A-D-P-H – w probówkach do mikrocentryfugi przez pięć minut.Wirowanie przy prędkości od 8 000 do 14 000 RPM spowoduje osadzenie wszelkich cząstek w roztworze, które mogłyby generować artefakty w linii bazowej termogramu ITC. Po wirowaniu należy dokładnie sprawdzić stężenia roztworów makrocząsteczki oraz liganda za pomocą spektroskopii UV-Vis i zapisać ich dokładne wartości.Następnie przygotuj odpowiednią objętość każdego roztworu do ITC, rozcieczając przygotowane roztwory zapasowe makrocząsteczki i ligandu do niezbędnych stężeń eksperymentalnych. Na koniec odgazuj próbki, aby uniknąć artefaktów sygnału spowodowanych pęcherzykami powietrza lub uwalnianiem rozpuszczonych gazów podczas miareczkowania, przed wprowadzeniem makrocząsteczki i ligandu do ITC. Oczyść komórkę pomiarową oraz strzykawkę dozującą zgodnie z protokołem producenta.Następnie przepłucz celę pomiarową dwa lub trzy razy 1.8 mililitrami wody destylowanej, używając strzykawki Hamiltona. Zachowaj ostrożność podczas posługiwania się strzykawką, ponieważ długa igła łatwo się wygina. Następnie kilkukrotnie przepłucz celę pomiarową taką samą objętością buforu.Po oczyszczeniu kuwety pomiarowej wprowadź do niej 1,8 mililitrów roztworu makrocząsteczek. Przerwij dodawanie próbki w momencie, gdy roztwór pojawi się u wylotu szyjki kuwety, uważając, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą strzykawki Hamiltona, delikatnie przesuwając igłę w górę i w dół wzdłuż ścianek kuwety, aby je usunąć.Wyciągnij strzykawkę i usuń nadmiar cieczy z otworu na górze kuwety. Następnie napełnij kuwetę referencyjną wodą destylowaną. Potem podłącz za pomocą rurki plastikową strzykawkę do portu napełniania strzykawki wstrzykującej.Otwórz port napełniania w konsoli VP viewer 2000. Przepłucz strzykawkę wtryskową wodą destylowaną, a następnie buforem. Upewnij się, że strzykawka wtryskowa została całkowicie opróżniona, zasysając powietrze przez układ.Wprowadzić igłę strzykawki do roztworu ligandu i pobrać roztwór do strzykawki, aż zostanie ona całkowicie wypełniona. Pobrać niewielką nadwyżkę objętości do portu, a następnie odłączyć przewód, natychmiast zamykając port napełniający. Odłączyć przewód oraz plastikowy element do przepłukiwania strzykawki, a następnie dwukrotnie wypłukać i ponownie napełnić strzykawkę, aby usunąć z niej wszelkie pęcherzyki powietrza.Wyjmij strzykawkę do wstrzykiwania z roztworu ligandu i wytrzyj krople z jej ścianek za pomocą chusteczki bezpyłowej (chem wipe). Należy uważać, aby nie dotknąć końcówki strzykawki chusteczką oraz nie potrącić strzykawki, ponieważ może to spowodować utratę objętości cieczy. Następnie ostrożnie umieść strzykawkę do wstrzykiwania w kuciecie z próbką.Skonfiguruj parametry pomiaru ITC w programie V VP viewer 2000 dostarczonym przez Micro Cal dla układów wiążących. W przypadku silnych sygnałów cieplnych, takich jak układ chromosomalnej reduktazy dihydrofolianowej z N-A-D-P-H, duża liczba iniekcji o małej objętości dostarczy więcej punktów danych do dopasowania. I odwrotnie, dla układów o słabych sygnałach cieplnych, zaleca się stosowanie niewielkiej liczby iniekcji o dużej objętości.Przy pierwszych jednej lub dwóch injekcjach ustaw objętość wtrysku na 2 µL. Iniekcje te zostaną ostatecznie odrzucone, ponieważ mogą przynieść błędne wyniki z powodu mieszania się roztworów ligandu i makromolekuły. Podczas wprowadzania czasu między injekcjami, odczekaj kilka minut, aby system osiągnął równowagę, a sygnał cieplny powrócił do linii bazowej.Następnie wybierz temperaturę eksperymentu i wprowadź prędkość mieszania strzykawki niezbędną do zapewnienia odpowiedniego zmieszania ligandu i makrocząsteczki podczas miareczkowania; po ustawieniu parametrów eksperymentalnych uruchom badanie. Po zakończeniu eksperymentu końcowy sygnał cieplny powinien być bliski nasyceniu. Oczyść ITC zgodnie z protokołem producenta i powtórz miareczkowania co najmniej jeden lub dwa razy, aby uzyskać powtarzalne dane.Na koniec przeprowadź kontrolę, w której ligand jest miareczkowany do buforu w komórce z próbką, aby określić ciepło rozcieńczenia liganda; dopasowanie danych można łatwo przeprowadzić za pomocą makr w dowolnym programie do dopasowywania danych. W celu zademonstrowania dopasowania danych użyto tutaj programu Origin seven dostarczonego przez MicroCal. Aby rozpocząć, wczytaj pierwszy plik danych.Sprawdź surowy termogram pod kątem pęcherzyków powietrza lub innych artefaktów w sygnale, takich jak skoki linii bazowej lub piki w miejscach, w których nie nastąpił wtrysk. Odnotuj te punkty danych, ponieważ powinny one zostać usunięte. Następnie wczytaj dane kontrolne dla rozcieńczenia ligandu i odejmij je od izotermy wiązania.Usuń wszystkie błędne punkty danych, w tym pierwsze kilka punktów miareczkowania, w których zazwyczaj występują artefakty rozcieńczenia. Następnie wybierz model dopasowania danych. Po wybraniu modelu można dopasować dane, ręcznie wprowadzając wartości początkowe parametrów dopasowania, w tym stechiometrię, entalpię oraz powinowactwo wiązania.Jeśli jednak z eksperymentów ortogonalnych znana jest wcześniejsza wartość któregokolwiek z parametrów, należy ją wprowadzić, aby zapobiec utknięciu danych w lokalnych minimach podczas dopasowania. Po dopasowaniu danych dla pierwszej miareczkowania, należy powtórzyć kroki analizy danych dla pozostałych izoterm. Alternatywnie, dane można dopasować globalnie, używając programu takiego jak said fat; aby rozpocząć dopasowanie globalne, należy zapisać dane w programie Origin jako plik .dat.Następnie zaimportuj dane do wspomnianego programu. Wybierz model dopasowania i przeprowadź globalne dopasowanie danych, przełączając się między opcjami dopasowania simplex i Marquardt-Levenberg, aż wartość globalnego chi-kwadrat osiągnie minimum. Reprezentatywna procedura ITC zaprezentowana w tym filmie monitoruje wiązanie N-A-D-P-H z chromosomalną dehydrogenazą reduktazą folianową e coli.Egzotermiczne wiązanie N-A-D-P-H z dihydrofolianową reduktazą jest widoczne na surowym termogramie jako wydzielanie ciepła. Malejące sygnały cieplne przy każdym kolejnym wtryskiwaniu wskazują na nasycenie wiązania, które następuje w pierwszej połowie miareczkowania. Czystość składników oraz dobre dopasowanie buforów widoczne są w nasyconej części wykresu, gdzie występują jedynie minimalne sygnały cieplne wynikające z ciepła rozcieńczenia liganda.Dane dopasowano do modelu jednowarstwowego za pomocą oprogramowania Origin, aby wyznaczyć izotermę wiązania. Następnie dwa zestawy danych dopasowano do modelu jednowarstwowego przy użyciu wspomnianej metody. Niewielkie wartości i losowy rozkład reszt wskazują, że parametry termodynamiczne są prawidłowe. Parametry te zostały również zweryfikowane poprzez porównanie z wartościami literaturowymi uzyskanymi metodami ortogonalnymi.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć sposób badania wiązania makrocząsteczka-ligand z wykorzystaniem VP-ITC firmy MicroCal, począwszy od prawidłowego przygotowania roztworów, poprzez konfigurację parametrów eksperymentalnych, aż po analizę danych.

isothermal-titration-calorimetry-for-measuring-macromolecule-ligand

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izotermiczna kalorymetria miareczkowa do pomiaru powinowactwa makrocząsteczka-ligand

ITC jest potężnym narzędziem do badania wiązania liganda z jego gospodarzem. Jednak w układach złożonych kilka modeli może równie dobrze dopasowywać się do danych. Metoda opisana w niniejszej pracy umożliwia wyjaśnienie odpowiedniego modelu wiązania dla układów złożonych oraz wyznaczenie odpowiadających im parametrów termodynamicznych.

Gromadzenie zbiorów danych izotermicznej kalorymetrii miareczkowej o zmiennym stężeniu w celu określenia mechanizmów wiązania

Ten film demonstruje różnicową kalorymetrię skaningową - technikę badania interakcji między biomolekułą a ligandem. Wiązanie aptameru DNA i liganda termolabilnego bada się poprzez zastosowanie powtarzających się cykli ogrzewania i chłodzenia do próbki oraz uzyskanie skanów do analizy termodynamicznej.

Różnicowa kalorymetria skaningowa do badania interakcji DNA aptamer-termolabilny ligand

Izotermiczna kalorymetria miareczkowa mierzy przepływ ciepła uwalnianego lub pochłanianego w reakcjach chemicznych. Metoda ta może być stosowana do ilościowego określania katalizy enzymatycznej. W tym artykule ogólnie opisano protokół konfiguracji instrumentalnej, prowadzenia eksperymentu i analizy danych, który jest stosowany do charakterystyki enzymatycznej hydrolizy mocznika za pomocą ureazy fasoli jack.

Gorąca kataliza biologiczna: kalorymetria miareczkowa izotermiczna w celu scharakteryzowania reakcji enzymatycznych

Różnicowa fluorymetria skaningowa jest powszechnie stosowaną metodą badania bibliotek małych cząsteczek pod kątem interakcji z białkami. W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę rozszerzenia tych analiz w celu oszacowania stałej dysocjacji między małą cząsteczką a jej białkiem partnera.

Oznaczanie oddziaływań białko-ligand za pomocą różnicowej fluorymetrii skaningowej

Przedstawiamy protokół do szybkiej charakterystyki biomolekularnych oddziaływań fałdowania i wiązania z termolabilnymi ligandami za pomocą różnicowej kalorymetrii skaningowej.

Pomiar biomolekularnych profili DSC za pomocą termolabilnych ligandów w celu szybkiego scharakteryzowania interakcji fałdowania i wiązania

Opisano szczegółowe protokoły wykonywania titracji ELISA. Ponadto przedstawiono nowy algorytm do oceny titracji ELISA i uzyskania stałej dysocjacji wiązania rozpuszczalnego ligandu z receptorem unieruchomionym na płytce mikrotytlacyjnej.

Oznaczanie titracji ELISA jako metoda wyznaczania stałej dysocjacji oddziaływań ligand-receptor

Pomiary zaangażowania docelowego leku są kluczowe dla skutecznego rozwoju leków i walidacji sond chemicznych. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół pomiaru zaangażowania leku w cel za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości w kompatybilnej z mikropłytką adaptacji komórkowego testu przesunięcia termicznego (CETSA).

Wykorzystanie obrazowania o wysokiej zawartości do ilościowego określenia zaangażowania celu w przylegających komórkach

Stabilność termiczną aktywności enzymu można łatwo zmierzyć za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC). Większość obecnie stosowanych testów stabilności białek mierzy rozwijanie białek, ale nie dostarcza informacji o aktywności enzymatycznej. ITC umożliwia bezpośrednie określenie wpływu modyfikacji enzymów na stabilność aktywności enzymu.

Pomiar stabilności enzymatycznej za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej

Termoforeza w mikroskali szybko uzyskuje stałe wiązania przy niskich kosztach materiałowych. Na rynku dostępna jest termoforeza w mikroskali znakowana lub bezetykietowa; Jednak termoforeza bezznacznikowa nie jest w stanie zapewnić różnorodności pomiarów interakcji, które można wykonać przy użyciu etykiet fluorescencyjnych. Udostępniamy protokół dla znakowanych pomiarów termoforezy.

Zastosowanie termoforezy w mikroskali do pomiaru interakcji białko-lipid

Obecny protokół opisuje użycie izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC) do analizy kinetyki asocjacji i dysocjacji wiązania między aptamerem DNA a tetracykliną, w tym przygotowania próbek, uruchamiania wzorców i próbek oraz interpretacji uzyskanych danych.

Określanie asocjacji termodynamicznej i kinetycznej aptameru DNA i tetracykliny za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej

Poznaj kalorymetrię miareczkową izotermiczną do badania wiązań ligand-makrocząsteczka. Ta metoda pozwala wyznaczyć entalpię i entropię wiązania w jednym eksperymencie.

Izotermiczna kalorymetria miareczkowa w pomiarach powinowactwa makrocząsteczek do ligandów

Przeglądaj więcej filmów