Wykrywanie tlenku azotu i anionorodnika ponadtlenkowego w komórkach za pomocą spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego z wykorzystaniem pułapek spinowych

Nazywam się Frederick Dina i jestem profesorem nadzwyczajnym farmakologii na Uniwersytecie stanowym Ohio. W tej demonstracji przedstawimy metodę detekcji tlenku azotu oraz anionorodnika ponadtlenkowego w komórkach z wykorzystaniem EPR i pułapkowania spinowego.

Reaktywne formy tlenu i azotu są zaangażowane w rozwój wielu chorób, dlatego ich wykrywanie w systemach biologicznych ma kluczowe znaczenie. W systemach biologicznych stosowano jedynie kilka niezawodnych metod wykrywania reaktywnych form, jednak są one ograniczone pod względem swoistości i czułości. Powszechnie stosowaną metodą identyfikacji reaktywnych form tlenu jest pułapkowanie spinowe, które polega na reakcji addycji rodnika do nitrospinowej pułapki lub kompleksów metali, w wyniku czego powstaje trwały addukt spinowy, który można wykryć za pomocą spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR). Różne addukty rodnikowe wykazują charakterystyczne widma, które mogą służyć do identyfikacji generowanych rodników i dostarczać wielu informacji na temat natury oraz kinetyki ich powstawania.

Syntaza tlenku azotu katalizuje przekształcenie L-argininy w L-cytrulinę przy użyciu NADPH w celu wytworzenia tlenku azotu. W warunkach stresu oksydacyjnego enzym ten może przejść z produkcji tlenku azotu na produkcję anionorodnika ponadtlenkowego w procesie zwanym rozsprzęganiem, który prawdopodobnie jest wywołany utlenieniem hemu lub kofaktora determinującego produkcję. Regulacja tlenku azotu w układach biologicznych jest istotna, ponieważ odgrywa on krytyczną rolę w sygnalizacji komórkowej, prowadząc do korzystnych funkcji fizjologicznych, takich jak wazodylatacja, jednak jego nadprodukcja jest często powiązana ze stanami zapalnymi. Dlatego detekcja tlenku azotu w układach biologicznych jest ważna.

Kolejną ważną klasą cząsteczek sygnałowych w systemach biologicznych są reaktywne formy tlenu, takie jak tlenek azotu; reaktywne formy tlenu w niskich stężeniach odgrywają istotną rolę w regulacji funkcji komórkowych, sygnalizacji i odpowiedzi immunologicznej, jednak w niekontrolowanych stężeniach mogą prowadzić do komórkowych uszkodzeń oksydacyjnych, skutkujących stresem oksydacyjnym. Anionorodnik ponadtlenkowy jest jedną z najważniejszych reaktywnych form tlenu i stanowi główny prekursor niektórych z najsilniej utleniających związków znanych w systemach biologicznych, takich jak azotyn ponadtlenkowy i rodnik hydroksylowy. Detekcja i/lub sekwestracja ponadtlenku w systemie biologicznym jest zatem istotna, ponieważ jego generowanie stanowi pierwszą oznakę wyrzutu oksydacyjnego przed jego pełnym rozpoczęciem.

Niniejszy protokół opisuje trypsynizację hodowanych komórek śródbłonka aorty bydlęcej zgodnie z opisaną procedurą pisemną. Przenieś komórki na opisaną płytkę sześciodołkową i inkubuj przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2 po zakończeniu inkubacji.

Wyjmij płytkę sześciodołkową z inkubatora i odessij pożywkę z pierwszej studni. Przemyj komórki dwukrotnie 1 mL buforu fosforanowo-solnego z dekstrozą (DPBS). Przygotuj 1,9 mM roztwór siarczanu żelaza(II) siedmiowodnego, dodając 0,8 mg siarczanu żelaza(II) do 1 mL DPBS z chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu.

Przygotować roztwór MGD, dodając 2,7 mg MGD amonu do 500 µL DPBS z chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu. Dodać 210 µL świeżo przygotowanego 1,9 mM siarczanu żelaza(II) heptahydratu oraz 210 µL świeżo przygotowanego MGD, zachowując stosunek molowy jeden do siedmiu, a następnie wymieszać powstałą zawiesinę. Dodać 4,6 µL jonów wapnia IV i ponownie wymieszać roztwór, pipetując go w górę i w dół.

Następnie inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 36 minut. Zebrać supernat do probówki typu Eppendorf. Wprowadzić parametry akwizycji EPR: pole centrum 34,27 G, amplitudę modulacji 6 G oraz częstotliwość 9,8 GHz.

Ponieważ parametry różnią się w zależności od urządzenia i warunków eksperymentalnych, należy zapoznać się z tekstem w celu sprawdzenia pozostałych parametrów stosowanych w tym sprzęcie. Przenieś nadsącz do płaskiej celi EPR, uszczelnij ją parafので i umieść w kawie EPR. Po uruchomieniu eksperymentu zarejestruj widma przez około 21 minut, wykonując 121 skanów z czasem 10,4 seconds na skan.

Użyj oprogramowania Bruker WIN EPR do korekcji linii bazowej i całkowania widm 2D, co pozwala na redukcję szumów tła. Należy zauważyć, że czas skanowania oraz liczba skanów mogą się różnić w zależności od eksperymentu. Metody korekcji linii bazowej mogą być również zróżnicowane w zależności od stosowanego oprogramowania.

Aby rozpocząć rozprzęganie Enos, usunąć pożywkę z drugiej studni płytki sześciodołkowej i przemyć komórki dwukrotnie 1 mL DPBS. Następnie dodać 100 µL przygotowanego 0,5 mM roztworu Syn one i uzupełnić objętość do 2 mL za pomocą DPBS zawierającego 10% FBS. Inkubować komórki przez dwie godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Po inkubacji.

Przemyj komórki dwukrotnie DPBS. Następnie dodaj 210 µL świeżo przygotowanego, 2.8 mM siarczanu żelaza(II) heptahydratu oraz 210 µL 19.6 mM MGD, przygotowanego zgodnie z poprzednią procedurą. Następnie dodaj 4.6 µL 1.9 mM jonów wapnia i ponownie wymieszaj roztwór.

Podobnie jak poprzednio, inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez 36 minut. Po 36 minutach zbierz nadsącz, który osadził się w probówce typu Eppendorf, i przenieś go do płaskiej kuwety EPR. Zarejestruj widma EPR, stosując te same parametry akwizycji co poprzednio, zgodnie z procedurą pomiarową.

Przetwórz dane w ten sam sposób przed rozpoczęciem niniejszego protokołu. Przygotuj roztwór zapasowy 1 M DMPO oraz PBS zawierający 0,1 mM DTPA. Następnie przygotuj roztwór o stężeniu 1 mg/mL w proporcji 4 do 12.

Przygotować alikwoty po 1 ml roztworu zapasowego PMA w DMSO, rozcieńczając go do stężenia 10 µg/ml w PBS w probówce typu Eppendorf zawierającej 1 mg/ml D-glukozy i 1 mg/ml albuminy. Przygotować zawiesinę PMN o zagęszczeniu od 5 do 6 milionów komórek na ml, pipetując w górę i w dół w probówce typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Przygotować mieszaninę o końcowej objętości 60 µl zawierającą około 1,6 × 10⁶ komórek PMN, 10 mM DMPO oraz 0,2 µg/ml PMA.

W tym doświadczeniu wykorzystamy spektrometr pasma X Bruker ESP 300. Przenieś roztwór do płaskiej kuwety EPR, a następnie umieść kuwetę w rezonatorze EPR. Wprowadź parametry akwizycji EPR: pole centralne 3,486 goss, amplitudę modulacji 0,5 goss oraz częstotliwość 9,8 gigahertz.

Ponieważ parametry różnią się w zależności od instrumentu oraz warunków eksperymentalnych, należy zapoznać się z treścią w celu sprawdzenia pozostałych parametrów wykorzystanych w tym doświadczeniu podczas pozyskiwania widm. W tej demonstracji pokazujemy detekcję tlenku azotu oraz rodników nadtlenkowych SU przy użyciu dwóch różnych pułapek spinowych: żelazowego MGD oraz DNPO.

Wykazujemy, że stymulacja komórek śródbłonka jonami wapnia produkuje tlenek azotu, a zastosowanie donora azotynów może zmniejszyć produkcję tlenku azotu. Jednakże stymulacja neutrofili za pomocą PMA w obecności pułapki spinowej nitro daje rodnik hydroksylowy ADDA zamiast S-tlenku ze względu na niestabilność początkowo powstałego nadtlenku adda. Chociaż mechanizmy pułapkowania spinów przez iron mg d nitros są zasadniczo takie same, przyłączanie tlenku azotu do iron MGD wiąże się z szybką szybkością reakcji, a forma addyktu tlenku azotu z iron MGD jest bardzo stabilna.

W rzeczywistości roztwór można zamrozić w temperaturze -80 °C w celu późniejszego pozyskania widma EPR bez znaczącego spadku intensywności sygnału EPR. Z drugiej strony, detekcja tlenku przy użyciu nitrospinowej pułapki spinowej jest powolna. Wymaga to zastosowania wyższych stężeń pułapki spinowej w porównaniu z odpowiednikiem MGD czterech do detekcji tlenku azotu.

W celu skutecznego wykrycia formy adduktu ponadtlenku zastosowano kilka podejść, których nie prezentujemy już w tym filmie. Wykorzystanie kuwety płaskiej może na przykład zapewnić lepszą intensywność sygnału adduktu ponadtlenku dzięki wyższej gęstości komórek. Zachęcam do zapoznania się z tekstem w tej kwestii.

Ponadto zamiast DMPO można zastosować certyfikowane pułapki spinowe, takie jak BMPO i VMP lub fosforylowany Nitro DAP MPO, które mogą dawać bardziej trwałe addukty nadtlenku SU. W celu stabilizacji adduktów nadtlenku SU podczas stosowania pułapkowania spinowego do detekcji US wykorzystywano również cyklodekstrynę. Wysoce zaleca się niezwłoczną akwizycję widma EP po generowaniu supertlenku SU.

W związku z tym detekcja tlenku azotu przy użyciu MGD żelaza jest znacznie bardziej wydajna, a głównym wyzwaniem, przed którym obecnie stoi pułapkowanie spinowe anionorodnika ponadtlenkowego metodą EPR, jest osiągnięcie charakterystyki obserwowanej podczas tworzenia adduktu tlenku azotu z MGD żelaza. Chodzi o szybką reaktywność wobec anionorodnika ponadtlenkowego oraz trwałe addukty. Obecnie w naszym laboratorium, a także w innych grupach badawczych, prowadzone są prace nad opracowaniem pułapek spinowych o szybkiej reaktywności wobec anionorodnika ponadtlenkowego i zdolności do tworzenia trwałych adduktów spinowych.