Name: Wykrywanie tlenku azotu i anionów rodników ponadtlenkowych za pomocą spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego z komórek przy użyciu pułapek spinowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Poznaj wykrywanie tlenku azotu i rodników ponadtlenkowych w komórkach za pomocą spektroskopii EPR z pułapkami spinowymi. Ta metoda pozwala identyfikować reaktywne gatunki zaangażowane w rozwój chorób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta została sfinansowana z grantu RO1 HL81248 przyznanego przez Narodowy Instytut Serca, Płuc i Krwi (NIH National Heart, Lung, and Blood Institute).

1. Hodowla byczych komórek śródbłonka aorty (BAEC)
<ol>
 <li>Przestrzegano odpowiednich zasad aseptyki.</li>
 <li>W łaźni wodnej ogrzano pożywkę bez antybiotyków do 37 °C.</li>
</ol>
Uwaga: Pożywka składa się z wolnego od fenolu DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) z 4.5 g/L D-glucose, 4 mM L-glutamine, 1% nieessential amino acids, uzupełnionego o 10% FBS (fetal bovine serum) oraz 2.5 mg/L czynnika wzrostu śródbłonka.
<ol start="3">
 <li>Wyjąć z inkubatora kolbę T75 zawierającą komórki i oczyścić jej powierzchnię 70% etanolem przed umieszczeniem jej w dygestorium. </li>
 <li>Usunąć stare pożywkę za pomocą aspiratora i przemyć dwukrotnie 5 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS). </li>
 <li>Dodać 2 ml trypsyny i odczekać 4-5 min do odklejenia się komórek, okresowo kontrolując proces pod mikroskopem. </li>
 <li>Dodać 3 ml pożywki i kilkakrotnie wymieszać za pomocą pipety, aby rozdzielić komórki i stworzyć jednorodną zawiesinę. </li>
 <li>Przenieść 5 ml pożywki z trypsyną do probówki 15 ml i wirować przy 121 g przez 5 min. </li>
 <li>Usunąć nadsącz za pomocą aspiratora. Dodać 5 ml DPBS i dokładnie wymieszać. Wirować przy 121 g przez 5 min. </li>
 <li>Odssać nadsącz i zawiesić ponownie osad komórkowy, dodając 6 ml pożywki. </li>
 <li>Do każdego dołka płytki 6-dołkowej dodać 1 ml zawiesiny komórkowej, a następnie dodać 1 ml pożywki. Wymieszać zawiesinę za pomocą pipety. </li>
 <li>Opisać płytkę i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2. </li>
</ol>
2A. Detekcja NO w komórkach BAEC
<ol>
 <li>Zastosowano odpowiednie techniki aseptyczne. </li>
 <li>Wyjmij płytkę 6-dołkową z inkubatora i odessij medium z pierwszego dołka. Przemyj komórki dwukrotnie 1 ml DPBS. </li>
 <li>Dodaj 210 μl 1,9 mM siedmiowodnianu siarczanu żelaza(II) (FeSO4.7H2O, przygotowanego na świeżo poprzez rozpuszczenie 0,8 mg w 1 ml DPBS z CaCl2 i MgCl2) oraz 210 μl ditiokarbaminianu N-metylo-D-glukaminy amonu (MGD, przygotowanego na świeżo poprzez rozpuszczenie 2,7 mg w 500 μl DPBS z CaCl2 i MgCl2), zachowując stosunek 1:7. (Uwaga: Stosunek ten, w którym zastosowano nadmiar MGD, jest konwencjonalnie wykorzystywany do przygotowania kompleksu Fe2+-MGD ze względu na fakt, że wydajność Fe3+-MGD jest maksymalizowana w obecności nadmiaru MGD. Dodatek askorbinianu do roztworu w celu stabilizacji Fe2+-MGD nie jest konieczny, ponieważ utworzony NO-Fe3+-MGD jest endogennie redukowany do wykrywalnego metodą EPR NO-Fe2+-MGD przez askorbinian, hydrochinon lub cysteinę z wydajnością konwersji do 99,9%. Stan diamagnetyczny niskiego spinu Fe2+ umożliwia detekcję NO przy użyciu płaskiej celi lub rurki kapilarnej bez konieczności stosowania urządzenia do niskich temperatur)15. </li>
 <li>Dobrze wymieszaj powstałą zawiesinę i dodaj 4,6 μl jonoforu wapnia (CaI) (przygotowanego z roztworu stokowego 1,9 mM poprzez rozpuszczenie 1 mg w 1 ml DMSO). </li>
 <li>Ponownie wymieszaj roztwór i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 36 min, aby umożliwić dalszą redukcję NO-Fe3+-MGD do wykrywalnego metodą EPR NO-Fe2+-MGD. </li>
 <li>Zbierz nadsącz (425 μl) do probówki Eppendorfa i przenieś do płaskiej celi EPR (lub do rurki kapilarnej o pojemności 50 μl).</li>
 <li>Parametry akwizycji EPR to: częstotliwość mikrofal: 9,8 GHz; pole centralne: 3427 G; amplituda modulacji: 6,0 G; szerokość sweepu: 100 G; wzmocnienie odbiornika: 1 x 105; moc mikrofal: 10 mW; całkowita liczba skanów: 121; czas sweepu: 10 s; oraz stała czasowa: 20 ms. (Uwaga: Ponieważ parametry różnią się w zależności od urządzenia i warunków eksperymentalnych, najważniejszymi parametrami do rozważenia są jedynie pole centralne, częstotliwość i amplituda modulacji.) </li>
 <li>Zarejestruj widma w temperaturze pokojowej; widma 2-D zostały zintegrowane w celu redukcji szumu tła i poddane korekcji linii bazowej przy użyciu oprogramowania Bruker WinEPR Data Processing lub innego oprogramowania do przetwarzania danych. Do ilościowego oznaczenia tworzenia adduktów można sporządzić standardowe wykresy zależności stężenia od intensywności sygnału (lub pola) przy użyciu donora NO SNAP. </li>
</ol>
2B. Eksperyment dotyczący rozprzęgania eNOS
<ol>
 <li>Wyjąć płytkę 6-dołkową z inkubatora, odessać pożywkę z drugiego dołka i przemyć go dwukrotnie 1 ml DPBS. </li>
 <li>W celu rozprzęgnięcia eNOS16 zastosowano donor nadtlenku azotku, chlorek 5-amino-3-(4-morfolinilo)-1,2,3-oksadiazoliu (SIN-1). Dodać 100 μl 0,5 mM SIN-1 (Mr 206,6 g/mol, z roztworu zapasowego 10 mM świeżo przygotowanego poprzez rozpuszczenie 1 mg SIN-1 w 500 μl PBS bez jonów Ca/Mg) i rozcieńczyć do 2 ml za pomocą DPBS i 10% FBS. </li>
 <li>Inkubować przez 2 h w 37 °C i 5% CO2. </li>
 <li>Wyjąć płytkę z inkubatora i przemyć dwukrotnie DPBS.</li>
 <li>Dodać 210 μl 2,8 mM FeSO4.7H2O oraz 210 μl 19,6 mM MGD świeżo przygotowanego zgodnie z opisaną powyżej procedurą.</li>
 <li>Zamieszać roztwór i dodać 4,6 μl 1,9 mM CaI. </li>
 <li>Ponownie zamieszać roztwór i inkubować w 37 °C przez 36 min. </li>
 <li>Zebrać nadsącz (425 μl) do probówki Eppendorfa i przenieść do płaskiej celi EPR. </li>
 <li>Parametry akwizycji EPR to: częstotliwość mikrofal: 9,8 GHz; pole centralne: 3427 G; amplituda modulacji: 6 G; szerokość sweepu: 100 G; wzmocnienie odbiornika: 1 x 105; moc mikrofal: 10 mW; całkowita liczba skanów: 121; czas sweepu: 10 s; oraz stała czasowa: 20 ms. </li>
 <li>Zarejestrować widma; widma 2-D zintegrowano w celu zredukowania szumu tła i poddano korekcji linii bazowej zgodnie z powyższym opisem. </li>
</ol>
3. Wykrywanie O2•- z neutrofili polimorfojądrowych (PMN)
<ol>
 <li>Neutrofile wyizolowano z ludzkich próbek krwi zgodnie z wcześniej opisaną metodą17. </li>
 <li>Należy przygotować roztwór zapasowy 1 M DMPO* w PBS zawierającym 0,1 mM kwasu dietylenotriaminopentaoctowego (DTPA). DMPO ma temperaturę topnienia 25-29 °C, dlatego wygodniej jest pipetować ciekły DMPO (gęstość ~ 1,02 g/ml w 25 °C) do szklanej fiolki (Uwaga: do odważania nie należy używać plastikowych fiolek, ponieważ czysty DMPO reaguje z plastikiem). Zamrożony DMPO można rozpuścić, polewając fiolkę letnią wodą (Uwaga: nie należy używać gorącej wody, ponieważ DMPO może ulec rozkładowi).</li>
 <li>Ważne jest zastosowanie DMPO o wysokiej czystości (&gt; 99%), ponieważ niektóre z dostępnych komercyjnie pułapek spinowych zawierają zanieczyszczenia paramagnetyczne; dlatego niezbędne jest wykonanie widma EPR samego roztworu DMPO (w tym przypadku 10 mM). Krytyczne jest, aby nie było widocznego sygnału tła (patrz Rysunek 3A).</li>
 <li>Przygotować roztwór zapasowy (1 mg/ml) forbolu-12-mirystynianu-13-octanu (PMA) w DMSO. Przygotować alikwoty poprzez rozcieńczenie roztworu do stężenia 10 μg/ml w PBS. </li>
 <li>W probówce Eppendorfa o pojemności 1,5 ml przygotować roztwór o całkowitej objętości 0,6 ml, przestrzegając następującej kolejności dodawania: ~106 komórek PMN na ml, D-glukoza (1 mg/ml) i albumina (1 mg/ml), 10 mM DMPO oraz 0,2 μg/ml PMA. (Uwaga: PMA jest aktywatorem rodników i powinien zostać dodany na końcu). </li>
 <li>Przenieść roztwór do płaskiej kuwety EPR. </li>
 <li>Parametry akwizycji EPR są następujące: częstotliwość mikrofal: 9,8 GHz; pole centralne: 3486 G; amplituda modulacji: 0,5 G; zakres sweep: 100 G; wzmocnienie odbiornika: 5 x 105; całkowita liczba skanów: 10; czas sweep: 30 s; moc mikrofal: 20 mW oraz stała czasowa: 81 ms. Do ilościowego oznaczenia tworzenia adduktów można sporządzić standardowe wykresy zależności stężenia od intensywności sygnału (lub pola) z wykorzystaniem stabilnych nitroksydów, takich jak TEMPO lub kwas 3-karboksylowy-PROXYL. </li>
</ol>
* Ważna uwaga dotycząca stosowania DMPO: dzięki zastosowaniu płaskiej kuwety można zwiększyć gęstość komórek, a tym samym zwiększyć intensywność sygnału adduktu spinowego, jednak okres półtrwania adduktu O2•- z DMPO jest krótki (t1/2 ~ 1 min), a on sam rozkłada się do DMPO-OH. DMPO można zastąpić takimi samymi stężeniami EMPO, BMPO lub DEPMPO, które są dostępne w sprzedaży, w celu zwiększenia stabilności adduktu z t1/2 odpowiednio ok. 8 i 14 min.
4. Reprezentatywne wyniki
Pułapkowanie spinowe rodnika NO przeprowadzono z użyciem Fe2+-MGD. Rycina 2A i 2B nie wykazują sygnału EPR dla Fe2+-MGD ani mieszaniny Fe2+-MGD z CaI, co wskazuje, że od tych odczynników nie pochodzi sygnał tła NO. BAEC po stymulacji CaI uwalniają NO, który reaguje z Fe2+-MGD, tworząc addukt spinowy NO-Fe2+-MGD, co objawia się charakterystycznym sygnałem tripletowym o wartości stałej rozszczepienia nadsubtelnego (hfsc) aN = 12.66 G i czynniku g wynoszącym g= 2.040 (Rycina 2C). Wartość hfsc została wyznaczona przy użyciu programu symulacyjnego WINSIM, który można pobrać ze strony bazy danych oprogramowania EPR NIEHS. Eksperymentalna wartość hfsc jest zgodna z wartością literaturową aN=12.70 G i g = 2.04118 dla adduktu NO-Fe2+-MGD. Podobnie, wpływ SIN-1 na BAEC obniżył produkcję NO z powodu rozprzęgania eNOS, co przedstawiono na Rycini 2D.
Do detekcji O2•- wykorzystano pułapkę spinową DMPO. Sam DMPO nie generował sygnału, co pokazano na Rysunku 3A, potwierdzając tym samym, że pułapka spinowa jest wolna od zanieczyszczeń paramagnetycznych. Rysunek 3B przedstawia widmo samego DMPO i PMN; analogicznie nie stwierdzono wykrywalnego sygnału, co sugeruje, że DMPO nie powoduje aktywacji enzymu NADPH oksydaza. Rysunek 3C pokazuje zaobserwowany sygnał EPR po stymulacji PMN za pomocą PMA. Wartości hfsc dla tego sygnału określono jako aN =14,71 G, aβ-H =11,40 G oraz aγ-H =1,25 G, co jest zgodne z wartościami literaturowymi aN =14,3 G, aβ-H =11,7 G oraz aγ-H =1,3 G 19 dla adduktu DMPO-O2H.
<img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig1.jpg" alt="Schemat spektroskopii EPR przedstawiający proces generowania i analizy adduktów DMPO-O2 oraz NO-Fe2-MGD." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat blokowy detekcji rodników z neutrofili i BAEC przy użyciu pułapkowania spinowego EPR. (A) PMN zmieszano z DMPO i PMA, a otrzymaną mieszaninę przeniesiono do płaskiej kuwety EPR w celu pozyskania danych. (B) Komórki BAEC hodowano na płytce, a następnie przemyto DPBS. Dodano pułapkę spinową Fe(MGD)2 wraz z CaI. Roztwór dokładnie wymieszano i inkubowano. Mieszaninę przeniesiono do płaskiej kuwety EPR w celu pozyskania danych EPR. 
<img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig2.jpg" alt="Schemat widm elektronowego rezonansu spinowego z wariacjami sygnałów, analiza analityczna gatunków paramagnetycznych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Detekcja NO z BAEC metodą EPR. (A) Widmo samego Fe2+-MGD (B) Widmo samego Fe2+-MGD + CaI. (C) Widmo tripletowe wynikające z wychwytywania NO przez Fe2+-MGD z użyciem komórek stymulowanych CaI. (D) Widmo wykazujące spadek produkcji NO w wyniku traktowania komórek 0.5 mM SIN-1. 
<img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig3.jpg" alt="Wykres spektroskopii ESR przedstawiający dane widmowe, analizujący wpływ pola magnetycznego na gatunki w próbce." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Detekcja EPR DMPO-O2H z aktywowanych neutrofili. (A) Widmo samego 10 mM 
DMPO. (B) Widmo samych PMN w obecności 10 mM DMPO. (C) Widmo PMN aktywowanych PMA w obecności 10 mM DMPO.

<ol><li>Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconciling+the+chemistry+and+biology+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species.</a> Nat. Chem. Biol. 4, 278-286 (2008).</li>
<li>Winterbourn, C. C., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol+chemistry+and+specificity+in+redox+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Thiol chemistry and specificity in redox signaling.</a> Free Radic. Biol. Med. 45, 549-561 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Oxygen%2C+Gene+Expression%2C+and+Cellular+Function%22">Oxygen, Gene Expression, and Cellular Function</a>. Clerch, L. B., Massaro, D. J. , (1997).</li>
<li>Gutteridge, J. M. C., Halliwell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidants%3A+Molecules%2C+medicines%2C+and+myths%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Antioxidants: Molecules, medicines, and myths.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 393, 561-564 (2010).</li>
<li>Sumimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+regulation+and+evolution+of+Nox-family+NADPH+oxidases+that+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Structure, regulation and evolution of Nox-family NADPH oxidases that produce reactive oxygen species.</a> FEBS J. 275, 3249-3277 (2008).</li>
<li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIgnarro%2C+LJ+%22Editor+Nitric+Oxide%3A+Biology+and+Pathobiology%22">Editor Nitric Oxide: Biology and Pathobiology</a>. , Academic Press. San Diego, CA. (2009).</li>
<li>Moreau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+alkyl-+and+arylguanidines+on+the+stability+and+reactivity+of+inducible+NOS+heme-dioxygen+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Differential effects of alkyl- and arylguanidines on the stability and reactivity of inducible NOS heme-dioxygen complexes.</a> Biochemistry. 45, 3988-3999 (2006).</li>
<li>Vasquez-Vivar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+generation+by+endothelial+nitric+oxide+synthase%3A+the+influence+of+cofactors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Superoxide generation by endothelial nitric oxide synthase: the influence of cofactors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 9220-9225 (1998).</li>
<li>Villamena, F. A., Zweier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+by+EPR+spin+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid.+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Detection of reactive oxygen and nitrogen species by EPR spin trapping.</a> Antioxid. Redox Signal. 6, 619-629 (2004).</li>
<li>Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+trapping+of+superoxide+and+hydroxyl+radical%3A+practical+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Spin trapping of superoxide and hydroxyl radical: practical aspects.</a> Arch. Biochem. Biophys. 200, 1-16 (1980).</li>
<li>Frejaville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Diethoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrroline+N-oxide+%28DEPMPO%29%3A+a+new+phosphorylated+nitrone+for+the+efficient+in+vitro+and+in+vivo+spin+trapping+of+oxygen-centered+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Soc.%2C+Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">5-Diethoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (DEPMPO): a new phosphorylated nitrone for the efficient in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals.</a> J. Chem. Soc., Chem. Commun. , 1793-1794 (1994).</li>
<li>Olive, G., Mercier, A., Le Moigne, F., Rockenbauer, A., Tordo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Ethoxycarbonyl-2-methyl-3%2C4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxide%3A+Evaluation+of+the+spin+trapping+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">2-Ethoxycarbonyl-2-methyl-3,4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxide: Evaluation of the spin trapping properties.</a> Free Radical. Biol. Med. 28, 403-408 (2000).</li>
<li>Villamena, F. A., Zweier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+radical+trapping+and+spin+adduct+decay+of+5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline+N-oxide+%28BocMPO%29%3A+kinetics+and+theoretical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Soc.%2C+Perkin+Trans%22%5BJournal%5D)">Superoxide radical trapping and spin adduct decay of 5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (BocMPO): kinetics and theoretical analysis.</a> J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1340-1344 (2002).</li>
<li>Tsuchiya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide-forming+reactions+of+the+water-soluble+nitric+oxide+spin-trapping+agent%2C+MGD%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide-forming reactions of the water-soluble nitric oxide spin-trapping agent, MGD.</a> Free Radical Biol. Med. 27, 347-355 (1999).</li>
<li>Vanin, A. F., Poltorakov, A. P., Mikoyan, V. D., Kubrina, L. N., van Faassen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+iron-dithiocarbamates+ensure+detection+of+nitric+oxide+in+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Why iron-dithiocarbamates ensure detection of nitric oxide in cells and tissues.</a> Nitric Oxide. 15, 295-311 (2006).</li>
<li>RojasWahl, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decomposition+mechanism+of+3-N-morpholinosydnonimine+%28SIN-1%29%3A+A+density+functional+study+on+intrinsic+structures+and+reactivities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Model%22%5BJournal%5D)">Decomposition mechanism of 3-N-morpholinosydnonimine (SIN-1): A density functional study on intrinsic structures and reactivities.</a> J. Mol. Model. 10, 121-129 (2004).</li>
<li>Klempner, M. S., Gallin, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+functional+characterization+of+human+neutrophil+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Separation and functional characterization of human neutrophil subpopulations.</a> Blood. 51, 659-669 (1978).</li>
<li>Pou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+trapping+of+nitric+oxide+by+ferro-chelates%3A+kinetic+and+in+vivo+pharmacokinetic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Spin trapping of nitric oxide by ferro-chelates: kinetic and in vivo pharmacokinetic studies.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1427, 216-226 (1999).</li>
<li>Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+trapping.+Kinetics+of+the+reaction+of+superoxide+and+hydroxyl+radicals+with+nitrones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Spin trapping. Kinetics of the reaction of superoxide and hydroxyl radicals with nitrones.</a> J. Am. Chem. Soc. 102, 4994-4999 (1980).</li>
<li>Britigan, B. E., Rosen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin-trapping+and+human+neutrophils.+Limits+of+detection+of+hydroxyl+radical%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Spin-trapping and human neutrophils. Limits of detection of hydroxyl radical.</a> J. Biol. Chem. 264, 12299-12302 (1989).</li>
<li>Frejaville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-%28Diethoxyphosphoryl%29-5-methyl-1-pyrroline+N-oxide%3A+A+new+efficient+phosphorylated+nitrone+for+the+in+vitro+and+in+vivo+spin+trapping+of+oxygen-centered+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">5-(Diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline N-oxide: A new efficient phosphorylated nitrone for the in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals.</a> J. Med. Chem. 38, 258-265 (1995).</li>
<li>Snyrychova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+the+sensitivity+of+EPR+spin+trapping+in+biological+systems+by+cyclodextrins%3A+A+model+study+with+thylakoids+and+photosystem+II+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Improvement of the sensitivity of EPR spin trapping in biological systems by cyclodextrins: A model study with thylakoids and photosystem II particles.</a> Free Radical Biol. Med. 48, 264-274 (2010).</li>
<li>Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipophilic+beta-cyclodextrin+cyclic-nitrone+conjugate%3A+Synthesis+and+spin+trapping+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Lipophilic beta-cyclodextrin cyclic-nitrone conjugate: Synthesis and spin trapping studies.</a> J. Org. Chem. 74, 5369-5380 (2009).</li>
<li>Han, Y., Tuccio, B., Lauricella, R., Villamena, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+spin+trapping+properties+by+beta-cyclodextrin-cyclic+nitrone+conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Improved spin trapping properties by beta-cyclodextrin-cyclic nitrone conjugate.</a> J. Org. Chem. 73, 7108-7117 (2008).</li>
<li>Hardy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+characterization%2C+and+decay+kinetics+of+ROS+and+thiyl+adducts+of+mito-DEPMPO+spin+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Detection, characterization, and decay kinetics of ROS and thiyl adducts of mito-DEPMPO spin trap.</a> Chem. Res. Toxicol. 20, 1053-1060 (2007).</li>
<li>Kim, S. -U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+reactivity+of+a+cyclic+nitrone-calix%5B4%5Dpyrrole+conjugate+with+superoxide+radical+anion%3A+Theoretical+and+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Fast reactivity of a cyclic nitrone-calix[4]pyrrole conjugate with superoxide radical anion: Theoretical and experimental studies.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 17157-17173 (2010).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Pułapkowanie spinowe EPR jest stosowane w szerokim zakresie zastosowań biomedycznych do ilościowego oznaczania i identyfikacji wolnych rodników. Pułapkowanie spinowe charakteryzuje się wysoką czułością, umożliwiając detekcję rodników w stężeniach od nM do μM, co czyni je odpowiednim do zastosowań w systemach biologicznych. Podstawą detekcji NO via EPR jest tworzenie paramagnetycznego adduktu NO-Fe2+-MGD. Fe2+-MGD reaguje z NO szybko18, ze stałą szybkości ok. 106 M...

<table><tbody><tr><td>Pożywka DMEM bez fenolu&lt;br/&gt; Wysoka zawartość glukozy 1X</td><td>GIBCO</td><td>31053</td><td> </td></tr><tr><td>0.25% Trypsyna-EDTA</td><td>GIBCO</td><td>25200</td><td> </td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP379-100</td><td> </td></tr><tr><td>Niezbędne aminokwasy MEM</td><td>GIBCO</td><td>11140</td><td> </td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td> </td></tr><tr><td>Endotelialny czynnik wzrostu</td><td>Millipore</td><td>02-102</td><td> </td></tr><tr><td>CaI</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>A-23187</td><td>Rozpuścić w DMSO</td></tr><tr><td>SIN-1</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-CN245-0020</td><td> </td></tr><tr><td>DMPO</td><td>Dojindo Laboratories</td><td>D048-10</td><td> </td></tr><tr><td>FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>215422-250G</td><td>Rozpuścić w PBS z Ca i Mg</td></tr><tr><td>MGD</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-400-014-M050</td><td>Rozpuścić w PBS z Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; i Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Komórki BAEC</td><td>Cell Systems</td><td>2B2-C75</td><td> </td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td> </td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td> </td></tr><tr><td>DPBS z CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; i MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td> </td></tr><tr><td>Octan forbolu mirystynianu (PMA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>79346-1MG</td><td> </td></tr></tbody></table>

wykrywanie tlenku azotu i anionoradykału ponadtlenkowego w komórkach za pomocą spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego z użyciem pułapek spinowych

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reaktywne formy azotu i tlenu (RNS/ROS) w niskich stężeniach odgrywają istotną rolę w regulacji funkcji komórkowych, sygnalizacji i odpowiedzi immunologicznej, jednak w stężeniach niekontrolowanych są szkodliwe dla żywotności komórek1, 2. Chociaż systemy żywe wykształciły endogenne i dietetyczne mechanizmy obrony antyoksydacyjnej w celu regulacji generowania ROS, formy te są produkowane w sposób ciągły jako naturalne produkty uboczne prawidłowego metabolizmu tlenu i mogą powodować uszkodzenia oksydacyjne biomolekuł, co skutkuje utratą funkcji białek, rozszczepieniem DNA lub peroksydacją lipidów3, a w konsekwencji prowadzi do stresu oksydacyjnego wywołującego uszkodzenie lub śmierć komórki4.
Anion rodnika ponadtlenkowego (O2•-) jest głównym prekursorem niektórych z najbardziej utleniających związków znanych w systemach biologicznych, takich jak nadtlenek azotowy i rodnik hydroksylowy. Generowanie O2•- stanowi pierwszy sygnał wybuchu oksydacyjnego, dlatego jego detekcja i/lub sekwestracja w systemach biologicznych jest istotna. W niniejszej demonstracji O2•- został wygenerowany z polimorfojądrowych neutrofili (PMN). Poprzez stymulację chemotaktyczną za pomocą forbolu-12-mirystynianu-13-octanu (PMA), PMN generują O2•- poprzez aktywację oksydazy dinukleotydowej fosforanowej (NADPH) oksydazy5.
Syntaza tlenku azotu (NO), występująca w trzech izoformach: indukowalnej, neuronalnej i śródbłonkowej (odpowiednio iNOS, nNOS i eNOS), katalizuje przekształcenie L-argininy w L-cytrulinę, wykorzystując NADPH do produkcji NO6. W niniejszej pracy wygenerowano NO z komórek śródbłonka. W warunkach stresu oksydacyjnego eNOS może na przykład przejść z produkcji NO na produkcję O2•- w procesie zwanym rozprzęganiem (uncoupling), który prawdopodobnie jest wywoływany przez utlenianie hemu7 lub kofaktora, tetrahydrobiopteryny (BH4)8.
Istnieje niewiele wiarygodnych metod wykrywania wolnych rodników w systemach biologicznych, a te są ograniczone pod względem swoistości i czułości. Pułapkowanie spinowe jest powszechnie stosowane do identyfikacji wolnych rodników i polega na reakcji addycji rodnika do pułapki spinowej, w wyniku której powstaje trwały addukt spinowy, który można wykryć za pomocą spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR). Różne addukty rodnikowe wykazują charakterystyczne widma, które mogą być wykorzystane do identyfikacji generowanych rodników i dostarczyć wielu informacji na temat natury oraz kinetyki powstawania rodników9.
Cykliczne nitrony, 5,5-dimetylopirrolina-N-tlenek, DMPO10, fosforylowany DEPMPO11 oraz estrowane EMPO12 i BMPO13, są powszechnie stosowane jako pułapki spinowe – te ostatnie wykazują dłuższy okres półtrwania dla adduktu O2•-. Ditiokarbaminian żelaza(II)-N-metylu-D-glukaminy, Fe(MGD)2, jest powszechnie używany do pułapkowania NO ze względu na wysoką szybkość tworzenia adduktu oraz wysoką stabilność adduktu spinowego14.

Spektroskopię elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) zastosowano do wykrywania tlenku azotu z bydlęcych komórek śródbłonka aorty oraz anionorodnika ponadtlenkowego z ludzkich neutrofili, wykorzystując odpowiednio ditiokarbaminian żelaza (II)-N-metylu-D-glukaminy, Fe(MGD)2, oraz 5,5-dimetylo-1-pyrolino-N-tlenek, DMPO.

Wykrywanie tlenku azotu i anionoradykału ponadtlenkowego w komórkach za pomocą spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego z użyciem pułapek spinowych

Reaktywne formy azotu i tlenu (RNS/ROS) w niskich stężeniach odgrywają istotną rolę w regulacji funkcji komórkowych, sygnalizacji i odpowiedzi immunologicznej, jednak w...

Nazywam się Frederick Dina i jestem profesorem nadzwyczajnym farmakologii na The Ohio State University. W tej demonstracji przedstawimy metodę wykrywania tlenku azotu oraz anionorodnika ponadtlenkowego w komórkach z wykorzystaniem EPR i pułapkownictwa spinowego.Reaktywne formy tlenu i azotu są zaangażowane w rozwój wielu chorób, dlatego ich detekcja w układach biologicznych ma kluczowe znaczenie. W układach biologicznych stosuje się niewiele wiarygodnych metod wykrywania form reaktywnych, a są one ograniczone pod względem swoistości i czułości. Powszechnie stosowaną metodą identyfikacji ROS jest jednak pułapkowanie spinowe, które polega na reakcji addycji rodnika do nitro-pułapki spinowej lub kompleksów metali, w wyniku czego powstaje trwały addukt spinowy, który można wykryć za pomocą spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR). Różne addukty rodnikowe wykazują charakterystyczne widma, które mogą być wykorzystane do identyfikacji generowanych rodników i mogą dostarczyć wielu informacji na temat natury i kinetyki powstawania rodników.Syntaza tlenku azotu katalizuje przekształcenie L-argininy w L-cytrulinę przy użyciu N-A-D-P-H w celu wytworzenia tlenku azotu. W wa

detection-nitric-oxide-superoxide-radical-anion-electron-paramagnetic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wykrywanie tlenku azotu i nadtlenku nadtlenku anionowego przez spektroskopię rezonansu paramagnetycznego elektronów z komórek z użyciem pułapek spinowych

Niniejszy protokół opisuje metodę trójwymiarowego obrazowania stężenia tlenu w skali mikronowej w bezpośrednim otoczeniu żywych komórek z wykorzystaniem mikroskopii rezonansu spinowego elektronów.

Mikroobrazowanie za pomocą rezonansu spin-elektronowego żywych organizmów do mapowania tlenu

Spektroskopia ESR z pułapkowaniem spinowym została wykorzystana do zbadania wpływu roślinnych przeciwutleniaczy, takich jak likopen, pyknogenol i ekstrakt z pestek winogron, na neutralizację wolnych rodników w fazie gazowej w dymie papierosowym.

Protokół wykrywania i neutralizacji wolnych rodników w fazie gazowej w głównym nurcie dymu papierosowego

Endogenna produkcja tlenku azotu (NO) reguluje szeroki wachlarz funkcji biologicznych. Coraz wyraźniej staje się jasne, że zaburzenia lub dysregulacja sygnalizacji opartej na NO są zaangażowane w wiele ludzkich chorób. Metody ilościowego oznaczania odpowiednich metabolitów NO mogą dostarczyć nowych diagnostycznych lub prognostycznych biomarkerów chorób ludzkich.

Techniki analityczne do badania bioaktywności tlenku azotu

W tym artykule opisujemy dostosowaną, stosunkowo łatwą metodę wykorzystującą barwnik fluorescencyjny diaminofluoresceiny-2 dioctan (DAF-2DA) i dihydroetydyd (DHE) do jednoczesnego wykrywania i wizualizacji wewnątrz komórkowego tlenku azotu (NO) i anionu ponadtlenkowego (O2.−) w świeżo wyizolowanych nienaruszonych aortach mysiego modelu otyłości.

En Face Wykrywanie tlenku azotu i ponadtlenku w warstwie śródbłonka nienaruszonych tętnic

Nowa metoda elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR), rapid scan EPR (RS-EPR), została zademonstrowana do przestrzennego obrazowania spektralnego 2D, która jest lepsza od tradycyjnej techniki ciągłej fali (CW) i otwiera nowe możliwości obrazowania in vivo. Wyniki są demonstrowane na częstotliwości 250 MHz, ale technika ta ma zastosowanie na dowolnej częstotliwości.

Szybki skan elektronowy rezonansu paramagnetycznego otwiera nowe możliwości obrazowania fizjologicznie ważnych parametrów in vivo

Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) jest jednoznaczną metodą pomiaru wolnych rodników. Zastosowanie selektywnych sond spinowych pozwala na wykrywanie wolnych rodników w różnych przedziałach komórkowych. Przedstawiamy praktyczną, efektywną metodę pobierania próbek biologicznych, która ułatwia obróbkę, przechowywanie i przenoszenie próbek do pomiarów EPR.

Zastosowanie elektronowego rezonansu paramagnetycznego w próbkach biologicznych w temperaturze otoczenia i temperaturze 77 K

Ten protokół opisuje konfigurację bioreaktora NMR w celu utrzymania żywotności zamkniętych komórek ludzkich przez okres do 72 godzin, po czym następuje czasowo-rozdzielcza akwizycja i analiza danych NMR w komórce. Metodologia ta jest stosowana do monitorowania wewnątrzkomórkowych oddziaływań białko-ligand w czasie rzeczywistym.

Monitorowanie interakcji białko-ligand w komórkach ludzkich za pomocą ilościowego NMR w komórce w czasie rzeczywistym przy użyciu bioreaktora o dużej gęstości komórek

Tutaj prezentujemy protokoły wykrywania tlenku azotu i jego biologicznie istotnych pochodnych za pomocą testów opartych na chemiluminescencji o wysokiej czułości.

Testy oparte na chemiluminescencji do wykrywania tlenku azotu i jego pochodnych z autooksydacji i związków nitrozowanych

Tutaj proponujemy usystematyzowany, dostępny i powtarzalny protokół do wykrywania komórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) w komórkach glejowych Müllera (MGC). Ta metoda określa ilościowo całkowite komórkowe poziomy ROS za pomocą cytometru przepływowego. Ten protokół jest bardzo łatwy w użyciu, odpowiedni i powtarzalny.

Kwantyfikacja reaktywnych form tlenu za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny i cytometrii przepływowej w komórkach glejowych Müllera

Generowanie anionów ponadtlenkowych jest niezbędne do stymulacji płytek krwi, a jeśli są rozregulowane, krytyczne dla chorób zakrzepowych. W tym miejscu przedstawiamy trzy protokoły selektywnego wykrywania anionów ponadtlenkowych oraz badania regulacji płytek krwi zależnej od redoks.

Alternatywne metody wykrywania wytwarzania anionów ponadtlenkowych w płytkach krwi

Poznaj wykrywanie tlenku azotu i rodników ponadtlenkowych w komórkach za pomocą spektroskopii EPR z pułapkami spinowymi. Ta metoda pozwala identyfikować reaktywne gatunki zaangażowane w rozwój chorób.

Wykrywanie tlenku azotu i anionów rodników ponadtlenkowych za pomocą spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego z komórek przy użyciu pułapek spinowych (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie tlenku azotu i anionoradykału ponadtlenkowego w komórkach za pomocą spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego z użyciem pułapek spinowych

Przeglądaj więcej filmów