Name: Nokaut za pośrednictwem lentiwirusa podczas erytropoezy ex vivo ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: Poznaj metodę nokautu TAL1 za pomocą lentiwirusa podczas erytropoezy ex vivo ludzkich komórek macierzystych CD34+. Protokół umożliwia badanie mechanizmów regulacji ekspresji genów w erytroidnym różnicowaniu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy L. Douay i M.C Giarratana (Université Paris VI, Francja) za wskazówki dotyczące różnicowania erytroidalnego ex vivo, D. Allan i H. Atkins (OHRI, Kanada) za dostarczenie próbek krwi (uzyskanych na podstawie decyzji Ottawa Hospital Research Ethics Board nr 2007804-01H), D. Trono (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne) za dostarczenie wektorów lentiwirusowych oraz F.J. Dilworth (OHRI, Kanada) za krytyczne przeczytanie manuskryptu. Projekt ten był finansowany z grantu CIHR (MOP-82813) przyznanego M.B. C.G. P. jest laureatem stypendium podoktorskiego Ontario Research Fund Computational Regulomics Training Postdoctoral Fellowship. M.B. piastuje stanowisko Canada Research Chair w zakresie regulacji ekspresji genów.

<ol><li>Orkin, S. H., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis%3A+an+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132, 631-644 (2008).</li>
<li>Kim, S. I., Bresnick, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+erythropoiesis%3A+emerging+mechanisms+and+principles%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of erythropoiesis: emerging mechanisms and principles.</a> Oncogene. 26, (2007).</li>
<li>Friend, C., Patuleia, M. C., De Harven, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocytic+maturation+in+vitro+of+murine+%28Friend%29+virus-induced+leukemic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Cancer+Inst+Monogr%22%5BJournal%5D)">Erythrocytic maturation in vitro of murine (Friend) virus-induced leukemic cells.</a> Natl Cancer Inst Monogr. 22, 505-522 (1966).</li>
<li>Weiss, M. J., Yu, C., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythroid-cell-specific+properties+of+transcription+factor+GATA-1+revealed+by+phenotypic+rescue+of+a+gene-targeted+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Erythroid-cell-specific properties of transcription factor GATA-1 revealed by phenotypic rescue of a gene-targeted cell line.</a> Mol Cell Biol. 17, 1642-1651 (1997).</li>
<li>Lozzio, B. B., Lozzio, C. B., Bamberger, E. G., Feliu, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipotential+leukemia+cell+line+%28K-562%29+of+human+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Soc+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">A multipotential leukemia cell line (K-562) of human origin.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 166, 546-550 (1981).</li>
<li>Giarratana, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+generation+of+fully+mature+human+red+blood+cells+from+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).</li>
<li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titration+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Curr Protoc Neurosci. Chapter 4, (2006).</li>
<li>Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+normal+hematopoietic+and+leukemia+stem+cell+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).</li>
<li>Amsellem, S., Ravet, E., Fichelson, S., Pflumio, F., Dubart-Kupperschmitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximal+lentivirus-mediated+gene+transfer+and+sustained+transgene+expression+in+human+hematopoietic+primitive+cells+and+their+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Maximal lentivirus-mediated gene transfer and sustained transgene expression in human hematopoietic primitive cells and their progeny.</a> Mol Ther. 6, 673-677 (2002).</li>
<li>Laurenti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+and+shRNA+expression+in+resident+hematopoietic+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Inducible gene and shRNA expression in resident hematopoietic stem cells in vivo.</a> Stem Cells. 28, 1390-1398 (2010).</li>
<li>Palii, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+genomic+targeting+of+the+transcription+factor+TAL1+in+alternate+haematopoietic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Differential genomic targeting of the transcription factor TAL1 in alternate haematopoietic lineages.</a> EMBO J. 30, 494-509 (2011).</li>
<li>Fibach, E., Manor, D., Oppenheim, A., Rachmilewitz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+maturation+of+human+erythroid+progenitors+in+liquid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Proliferation and maturation of human erythroid progenitors in liquid culture.</a> Blood. 73, 100-103 (1989).</li>
<li>Wada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+major+blood+group+antigens+on+human+erythroid+cells+in+a+two+phase+liquid+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Expression of major blood group antigens on human erythroid cells in a two phase liquid culture system.</a> Blood. 75, 505-511 (1990).</li>
<li>Sui, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin-independent+erythrocyte+production%3A+signals+through+gp130+and+c-kit+dramatically+promote+erythropoiesis+from+human+CD34%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin-independent erythrocyte production: signals through gp130 and c-kit dramatically promote erythropoiesis from human CD34+ cells.</a> J Exp Med. 183, 837-845 (1996).</li>
<li>Panzenbock, B., Bartunek, P., Mapara, M. Y., Zenke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+of+human+stem+cell+factor%2Ferythropoietin-dependent+erythroid+progenitor+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation of human stem cell factor/erythropoietin-dependent erythroid progenitor cells in vitro.</a> Blood. 92, 3658-3668 (1998).</li>
<li>Lindern, M. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glucocorticoid+receptor+cooperates+with+the+erythropoietin+receptor+and+c-Kit+to+enhance+and+sustain+proliferation+of+erythroid+progenitors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The glucocorticoid receptor cooperates with the erythropoietin receptor and c-Kit to enhance and sustain proliferation of erythroid progenitors in vitro.</a> Blood. 94, 550-559 (1999).</li>
<li>Freyssinier, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((amplification+and+characterization+of+a+population+of+human+erythroid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">amplification and characterization of a population of human erythroid progenitors.</a> Br J Haematol. 106, 912-922 (1999).</li>
<li>Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+human+red+blood+cell+production+from+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of human red blood cell production from hematopoietic progenitor cells.</a> Blood. 91, 2664-2671 (1998).</li>
<li>Carlile, G. W., Smith, D. H., Wiedmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-3+has+a+nonapoptotic+function+in+erythroid+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Caspase-3 has a nonapoptotic function in erythroid maturation.</a> Blood. 103, 4310-4316 (2004).</li>
<li>Mazurier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+and+efficient+selection+of+human+transduced+primitive+hematopoietic+cells+using+the+humanized+S65T+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis and efficient selection of human transduced primitive hematopoietic cells using the humanized S65T green fluorescent protein.</a> Gene Ther. 5, 556-562 (1998).</li>
<li>Salmon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+transgene+expression+in+human+hematopoietic+progenitors+and+differentiated+blood+lineages+after+transduction+with+improved+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-level transgene expression in human hematopoietic progenitors and differentiated blood lineages after transduction with improved lentiviral vectors.</a> Blood. 96, 3392-3398 (2000).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Wcześniej stosowano szereg metod różnicowania komórek erytroidalnych w kulturze z różnym stopniem powodzenia. Na przykład niektóre protokoły bez kokultury na komórkach MS-5 umożliwiają ekspansję komórek erytroidalnych, lecz nie są wydajne w produkcji w pełni dojrzałych, beżądrowych erytrocytów 12-17. Z kolei inne metody pozwalają na wydajną enukleację, jednak dzieje się to kosztem proliferacji 18,19. Metoda zastosowana w niniejszej pracy, opracowana pierwotnie w laboratorium Douay 6, łącz...

lentiwirusowy wyciszanie genów podczas erytropoezy ex vivo ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erytropoeza jest powszechnie stosowanym modelem badawczym w studiach nad różnicowaniem komórek. Podczas erytropoezy pluripotencjalne dorosłe ludzkie hematopoetyczne komórki macierzyste (HSCs) różnicują się w progenitorów oligopotencjalnych, zdeterminowane prekursory oraz dojrzałe krwinki czerwone 1. Proces ten jest w dużej mierze regulowany na poziomie ekspresji genów, przy czym specyficzne czynniki transkrypcyjne aktywują geny specyficzne dla danej linii komórkowej, jednocześnie represując geny charakterystyczne dla innych typów komórek 2. Badania nad czynnikami transkrypcyjnymi regulującymi erytropoezę są często prowadzone z wykorzystaniem ludzkich i mysich linii komórkowych, które w pewnym stopniu reprezentują komórki erytroidalne na określonych etapach różnicowania 3-5. Jednakże transformowane linie komórkowe mogą jedynie częściowo naśladować komórki erytroidalne i, co najważniejsze, nie pozwalają na kompleksowe badanie dynamicznych zmian zachodzących w miarę przechodzenia komórek przez wiele etapów w kierunku ich ostatecznego losu erytroidalnego. W związku z tym aktualnym wyzwaniem pozostaje opracowanie protokołu pozwalającego na uzyskanie stosunkowo homogennych populacji pierwotnych HSCs oraz komórek erytroidalnych na różnych etapach różnicowania w ilościach wystarczających do przeprowadzenia eksperymentów z zakresu genomiki i proteomiki.
W niniejszym opracowaniu opisujemy ex vivo protokół hodowli komórkowej w celu indukcji różnicowania erytroidalnego z ludzkich komórek macierzystych/progenitorowych krwiotwórczych wyizolowanych z krwi pępowinowej, szpiku kostnego lub krwi obwodowej osób dorosłych zmobilizowanej za pomocą G-CSF (leukaferezą). System hodowlany ten, opracowany pierwotnie przez laboratorium Douaya 6, wykorzystuje cytokiny i kokulturę komórek mezenchymalnych do naśladowania mikrośrodowiska szpiku kostnego. Wykorzystując tę ex vivo protokół różnicowania obserwujemy silną amplifikację progenitorów erytroidalnych, indukcję różnicowania wyłącznie w kierunku linii erytroidalnej oraz pełne dojrzewanie do stadium bezjądrowych erytrocytów. Zatem system ten stwarza możliwość badania molekularnego mechanizmu regulacji transkrypcyjnej w miarę postępu komórek macierzystych krwi wzdłuż linii erytroidalnej. 
Badanie erytropoezy na poziomie transkrypcyjnym wymaga również możliwości nadekspresji lub wyciszenia (knockdown) specyficznych czynników w pierwotnych komórkach erytroidalnych. W tym celu wykorzystujemy system dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusów, który umożliwia efektywne zakażanie zarówno komórek dzielących się, jak i niedzielących się 7. W niniejszej pracy wykazujemy, że jesteśmy w stanie efektywnie wyciszyć czynnik transkrypcyjny TAL1 w pierwotnych ludzkich komórkach erytroidalnych. Ponadto ekspresja GFP wykazuje wydajność infekcji lentiwirusowej bliską 90%. Tym samym nasz protokół zapewnia niezwykle użyteczny system do charakterystyki sieci regulacyjnej czynników transkrypcyjnych kontrolujących erytropoezę.

Opisano protokół ex vivo służący do generowania dojrzałych ludzkich erytrocytów z hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych. Dodatkowo opisano wydajną metodę dostarczania lentiwirusowego w celu wyciszenia czynnika transkrypcyjnego TAL1 w pierwotnych komórkach erytroidalnych. Wydajność dostarczania genów za pomocą lentiwirusów została zademonstrowana z wykorzystaniem wirusów ekspresyjących GFP.

Lentiwirusowy wyciszanie genów podczas erytropoezy ex vivo ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych

Erytropoeza jest powszechnie stosowanym modelem badawczym w studiach nad różnicowaniem komórek. Podczas erytropoezy pluripotencjalne dorosłe ludzkie komórki macierzyste krwi...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest różnicowanie ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w kierunku linii erytroidalnej oraz wyciszenie konkretnego czynnika transkrypcyjnego podczas erytropoezy ex vivo. Jest to realizowane poprzez wstępną izolację ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych CD34-dodatnich z krwi pępowinowej, szpiku kostnego lub krwi obwodowej zmobilizowanej za pomocą GCSF. Drugim krokiem procedury jest różnicowanie tych hematopoetycznych komórek macierzystych w kierunku linii erytroidalnej z wykorzystaniem czterostopniowej procedury hodowli komórkowej, która łączy specyficzne cytokiny i kokulturę na warstwie komórek stromalnych w celu naśladowania mikrośrodowiska szpiku kostnego.Następnie należy przygotować cząsteczki wektora lentiwirusowego wykazujące ekspresję cząsteczki HRNA przeciwko badanemu czynnikowi transkrypcyjnemu, cząsteczki HRA typu scrambled jako kontrolę negatywną oraz białka GFP w celu kontroli wydajności infekcji wirusowej. Ostatnim krokiem procedury jest zainfekowanie pierwotnych ludzkich komórek erytroidalnych na danym etapie różnicowania cząsteczkami lentiwirusowymi. W rezultacie można uzyskać dane obrazujące p

lentiviral-mediated-knockdown-during-ex-vivo-erythropoiesis-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Lentiwirusowo-pośredniczony Knockdown podczas ex vivo erytropoezy ludzkich komórek macierzystych krwiotwórczych

W tym filmie demonstrujemy metodę przeprowadzania transdukcji wektorów lentiwirusowych shRNA w celu uzyskania stabilnych linii komórkowych knockdown w unieśmiertelnionych hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (iHSPC).

Knockdown genów za pośrednictwem RNA za pośrednictwem krótkiej spinki do włosów w iHSPC in vitro: system ekspresji shRNA oparty na lentiwirusie dostarczany do iHSPC w celu wyeliminowania określonej ekspresji genów

Prezentujemy system hodowli erytroblastów wątroby in in vitro u myszy płodowej, który analizuje wczesne i późne stadia końcowej erytropoezy. System ten ułatwia analizę funkcjonalną określonych genów na różnych etapach rozwoju.

System hodowli wątroby płodu myszy do analizy funkcji genów docelowych we wczesnych i późnych stadiach erytropoezy terminalnej

Manipulowanie czasową ekspresją genów w różnicujących się embrionalnych komórkach macierzystych (ESC) można osiągnąć za pomocą indukowalnych systemów genetycznych. Jednak wytwarzanie tych linii komórkowych jest kosztowne i czasochłonne. Protokół ten zapewnia szybką ekspresję transgenu w różnicujących się komórkach pochodzących z ES, a następnie analizę dalszego różnicowania układu krwiotwórczego.

Zakażenie retrowirusowe mysich embrionalnych komórek ciała zarodkowego pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do analizy różnicowania układu krwiotwórczego

Ten protokół opisuje efektywną indukcję hemogennego śródbłonka i wielopotencjalnych hematopoetycznych komórek progenitorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych.

Bezpośrednia indukcja hemogennego śródbłonka i krwi przez nadekspresję czynników transkrypcyjnych w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Tutaj prezentujemy nasz protokół wytwarzania indukowanych erytroidalnych progenitorów (iEPs) z dorosłych fibroblastów myszy za pomocą bezpośredniego przeprogramowania linii (DLR) sterowanego czynnikiem transkrypcyjnym.

Bezpośrednie przeprogramowanie linii dorosłych fibroblastów myszy na erytroidalnych progenitorów

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek CD34+ naczelnych innych niż człowiek z przygotowanego szpiku kostnego, modyfikowanie genów tych komórek za pomocą wektorów lentiwirusowych oraz przygotowanie produktu do infuzji do autologicznego gospodarza. Łączna długość protokołu wynosi około 48 godzin.

Przygotowanie i modyfikacja genów hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych naczelnych

Opisane są protokoły wysoce efektywnej edycji genomu mysich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) przez system CRISPR/Cas9 w celu szybkiego rozwoju mysich systemów modelowych z modyfikacjami genów specyficznymi dla układu krwiotwórczego.

Edycja genomu za pośrednictwem lentiwirusowego CRISPR/Cas9 w celu badania komórek krwiotwórczych w modelach chorobowych

Tutaj udostępniamy protokół do badania potencjalnych czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w rozwój komórek dendrytycznych (DC) za pomocą lentiwirusowej transdukcji shRNA w celu uzyskania stabilnych linii komórkowych knockdown do różnicowania DC in vitro.

Badanie rozwoju komórek dendrytycznych przez knockdown genów za pośrednictwem krótkiej spinki do włosów za pośrednictwem RNA w linii komórek hematopoetycznych i progenitorowych in vitro

Używając taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI), wyprodukowaliśmy cząsteczki lentiwirusowe do stabilnej ekspresji shRNA w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych H9 (hESC) i przejściowo transdukowaliśmy neuronalne komórki progenitorowe (NPC) pochodzące z H9 z wysoką wydajnością.

Dostarczanie shRNA za pośrednictwem lentiwirusów do hESC i NPC przy użyciu taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI)

Obecny protokół opisuje zoptymalizowaną procedurę hodowli hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) w celu solidnego wszczepienia komórek z edytowanymi genami in vivo.

Edycja genów CRISPR/Cas9 hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych do zastosowań w terapii genowej

Modelowanie erytropoezy daje cenną szansę na zrozumienie biologicznego znaczenia aktorów w tym procesie i ocenę nowych podejść terapeutycznych, które mogą złagodzić wady różnicowania. W tym miejscu opisujemy prostą i niezawodną metodę skutecznego różnicowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ ex vivo.

Kompleksowy proces oceny skuteczności erytropoezy u ludzi in vitro i ex vivo

Poznaj metodę nokautu TAL1 za pomocą lentiwirusa podczas erytropoezy ex vivo ludzkich komórek macierzystych CD34+. Protokół umożliwia badanie mechanizmów regulacji ekspresji genów w erytroidnym różnicowaniu.

Lentiwirusowy wyciszanie genów podczas erytropoezy ex vivo ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów