Nokaut za pośrednictwem lentiwirusa podczas erytropoezy ex vivo ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych

Ogólnym celem tej procedury jest różnicowanie ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych wzdłuż linii erytroidalnej oraz wyeliminowanie określonego czynnika transkrypcyjnego podczas erytropoezy ex vivo. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie CD 34 dodatnich ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych z krwi pępowinowej, szpiku kostnego lub krwi obwodowej zmobilizowanej za pomocą GCSF. Drugim etapem procedury jest różnicowanie tych hematopoetycznych komórek macierzystych wzdłuż linii erytroidalnej za pomocą czteroetapowej procedury hodowli komórek, która łączy określone cytokiny i kokulturę na warstwie komórek zrębu w celu naśladowania mikrośrodowiska szpiku kostnego.

Następnie należy przygotować cząsteczki wektora lentiwirusowego wyrażające cząsteczkę HRNA przeciwko interesującemu czynnikowi transkrypcyjnemu, zaszyfrowaną cząsteczkę HRA jako kontrolę negatywną oraz białko GFP do kontrolowania skuteczności infekcji wirusowej. Ostatnim etapem zabiegu jest zakażenie pierwotnych ludzkich komórek erytroidalnych na danym etapie różnicowania cząstkami lentiwirusowymi. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują proliferację komórek i różnicowanie erytroidalne poprzez analizę morfologii komórek, zdolności tworzenia kolonii przodków, produkcji hemoglobiny i ekspresji markerów specyficznych dla erytroidów na podstawie faktów.

Skuteczność infekcji wirusowej jest analizowana poprzez pomiar ekspresji GFP na podstawie faktów, a knockdown czynnika transkrypcyjnego będącego przedmiotem zainteresowania jest analizowany przez R-T-Q-P-C-R. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie hematopoezy, takie jak mechanizm molekularny przez każdy czynnik transkrypcyjny, regulujący ekspresję genów w nieprzekształconym środowisku dostarczanym przez pierwotne komórki ludzkie. Jest to ważne dla zrozumienia podstawowych procesów hematopoezy, takich jak oznaczanie siarczanów, proliferacja samoodnawiania się lub apoptoza.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w normalne ROI i jego regulację na poziomie molekularnym, może być również wykorzystana jako system modelowy do badania ukierunkowanych terapii chorób wynikających z braku równowagi, wrastania i różnicowania, w tym zaburzeń mieloproliferacyjnych, takich jak czerwienica Vera Andro białaczka. Protokół erytropoezy ex vivo ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w celu dojrzewania hemoglobiny zawierającej czerwone krwinki składa się z dwóch etapów: izolacji ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD 34 dodatnich oraz różnicowania erytroidalnego wolnego od surowicy w hodowli komórkowej. W pierwszym etapie komórki CD 34 dodatnie są izolowane z krwi pępowinowej, szpiku kostnego lub ludzkiej krwi obwodowej mobilizowanej za pomocą GCSF przy użyciu pozytywnej selekcji immunologicznej.

Drugi etap: różnicowanie erytroidalne wolne od surowicy polega na hodowli komórek CD 34-dodatnich w płynnej hodowli. Zgodnie z czteroetapowym protokołem zaadaptowanym z metody pierwotnie opracowanej przez laboratorium DU od dnia zerowego do dnia 11, komórki krwiotwórcze są hodowane w uzupełnionych mankietach lodowych, zmodyfikowanych ECCO, pożywce zawierającej czynnik komórek macierzystych hydrokortyzonu interleukinę trzy i erytropoetynę. Następnie od 11 do 15 dnia komórki erytroidalne są kohodowane na pięciu komórkach mezenchymalnych SM w uzupełnionej pożywce IMDM zawierającej EPO w kroku trzecim.

Po zebraniu letnich komórek erytroidalnych do wykorzystania w przyszłości, pozostałe komórki są hodowane wspólnie na pięciu komórkach SM w uzupełnionym IMD i pożywce bez cytokin. Wreszcie, od 18 do 26 dnia, komórki erytroidalne są skoncentrowane trzy do czterech razy i utrzymywane na pięciowarstwowej warstwie SM, aby umożliwić dojrzewanie, a 10% FBS dodaje się do uzupełnionej pożywki IMDM w celu lepszego zachowania hodowanych czerwonych krwinek. Na potrzeby tego artykułu wideo pokażemy tylko drugi krok różnicowania erytroidalnego, kohodowlę komórek erytroidalnych na komórkach mezenchymalnych z erytropoetyną.

Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest wykonanie tych etapów na dużą skalę, przemycie i zastąpienie pożywki zawierającej pięć komórek AUS do hodowli ko, a następnie przeniesienie komórek handlu sztuką do tej kolby. Dlatego przetwarzamy na kolbę na raz i mamy jednocześnie 2% narządu. Aby rozpocząć kohodowlę komórek erytroidalnych na komórkach mezenchymalnych z EPO, policz komórki erytroidalne za pomocą błękitu trianowego, aby wykluczyć martwe komórki.

W dniu 11 gęstość komórek powinna wynosić około 1,5 razy 10 z sześciu komórek na mililitr rezerwuj około 80 mililitrów kultury komórek erytroidalnych do kohodowli na pięciu komórkach mezenchymalnych SM. Wstępnie podgrzany PBS uzupełnił pożywkę IMDM i uzupełnił pożywkę IMDM zawierającą EPO w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie wyjąć z inkubatora cztery wcześniej przygotowane kolby z zlewającymi się pięcioma komórkami MS.

Przemyć każdą kolbę 20 mililitrami jednego XPBS i natychmiast dodać 80 mililitrów świeżej pożywki IM DM zawierającej EPO do każdej kolby. Komórki należy przechowywać w inkubatorze podczas przygotowywania komórek erytroidalnych. Teraz przenieś zarezerwowane komórki erytroidalne do dwóch 50-mililitrowych stożkowych probówek i odwiruj przy 1500 RRP M przez 10 minut.

Po odrzuceniu sklarowanego osadu przemyj każdą z dwóch osadek komórkowych 20 mililitrami uzupełnionego roztworu IMDM, zawiesić każdą osadkę komórkową w 40 mililitrach uzupełnionej pożywki IMDM zawierającej EP. Następnie rozprowadzić 20 mililitrów tej zawiesiny komórkowej do każdej z czterech kolb zawierających pięć komórek MS i 80 mililitrów pożywki. W tym momencie powinieneś mieć cztery kolby z zlewającym się SM pięć komórek zawierających 100 mililitrów komórek erytroidalnych w ilości 0,3 razy 10 do sześciu komórek na mililitr następnego dnia, przeciw komórkom erytroidalnym błękitem trianowym, aby wykluczyć martwe komórki. Gęstość komórek powinna wynosić około 0,6 razy 10 do sześciu komórek na mililitr.

Zbierz niezbędną liczbę komórek do testów w celu sprawdzenia prawidłowej proliferacji komórek i różnicowania erytroidalnego. Badanie erytropoezy na poziomie transkrypcji wymaga również zdolności do nadmiernej ekspresji lub powalania określonych czynników w pierwotnych komórkach erytroidalnych. W tym przykładzie system dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusa jest używany do obniżenia czynnika transkrypcyjnego do jednego w pierwotnych ludzkich komórkach erytroidalnych.

Protokół przygotowania cząstek wektorów lentiwirusowych jest dostępny w manuskrypcie. Ten film pokaże procedurę infekcji lentiwirusowej pierwotnych komórek erytroidalnych w celu dostarczenia genów. Jądrzaste komórki erytroidalne mogą być skutecznie infekowane na każdym etapie różnicowania przy użyciu 50 do 100 wielokrotności infekcji.

W tym przypadku lentiwirus z ekspresją T jeden lub mieszankę S-H-R-N-A zostanie wykorzystany do zakażenia komórek erytroidalnych w ósmym i dziewiątym dniu różnicowania przy użyciu MOI wynoszącego 52 użycia na komórkę. Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj trzy 15-mililitrowe stożkowe probówki zawierające jedną dziesiątą szóstą komórkę erytroidalną, każda po jednej probówce do TAL jeden knockdown, jedną probówkę do zaszyfrowanej kontroli negatywnej i jedną probówkę do ekspresji GFP. Kontroluj mycie komórek pięcioma mililitrami uzupełnionej pożywki IMDM zawierającej EPO, wiruj z prędkością 1000 obr./min przez pięć minut i usuń jak najwięcej supernatantu.

Zakażenie powinno być przeprowadzane w minimalnych ilościach pożywki, aby umożliwić maksymalne wchłanianie lentiwirusa do komórek. Dodaj poli brain w końcowym stężeniu 40 mikrogramów na mililitr do każdej probówki skoncentrowanych lentiwirusów. Dodaj 100 mikrolitrów przygotowanego skoncentrowanego wirusa zawierającego poli mózg do każdej probówki komórek.

Inkubować przez godzinę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, mieszając stukając palcem co 10 minut. Umożliwia to równomierne rozprowadzenie wirusa w komórkach po zakończeniu godzinnej inkubacji w 1,9 mililitra uzupełnionej pożywki IMDM zawierającej EPO do każdej probówki. Przenieść każdą próbkę na płytkę sześciodołkową i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 24 godziny.

Po 24 godzinach zbierz komórki w oddzielnych 15-mililitrowych probówkach. Wirować je w temperaturze 1000 RRP M przez pięć minut i usunąć supernatant. Powtórz infekcję, dodaj wirusa i poli mózg i inkubuj przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z opukiwaniem palcem.

Następnie dodaj do komórek uzupełnioną pożywkę IMDM zawierającą EPO. Przenieść każdą próbkę na płytkę z sześciodołkową płytką i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia przenieść komórki do trzech 15-mililitrowych stożkowych probówek i przemyć przez odwirowanie, usunięcie supernatantu i zawiesiny rezowej komórek oraz wirówkę świeżej pożywki.

Ponownie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 0,2 razy 10 z sześciu komórek na mililitr do uzupełnionego IMDM zawierającego EPO. Następnie należy postępować zgodnie z procedurą różnicowania erytroidalnego ex vivo, komórki są liczone co drugi dzień podczas protokołu różnicowania erytroidalnego ex vivo. Reprezentatywny wynik w skali logarytmicznej pokazuje, że komórki są wysoce proliferacyjne, co ilustruje 10 000-krotna amplifikacja.

Ponadto może klejnot grunwaldu, więc barwienie morfologiczne wykonuje się co drugi dzień przy użyciu 0,05 razy 10 z sześciu komórek od zera do ośmiu i 0,2 razy 10 z sześciu komórek przez pozostałe dni. Jak pokazano na tym rysunku, komórki w poszczególnych stadiach różnicowania wykazują rozpoznawalne rozmiary i morfologie. Zwróć uwagę na proces enukleacji, który zachodzi pod koniec różnicowania, rozpoczynając się w 20 dniu.

W 26 dniu wszystkie komórki utraciły swoje jądra. Testy tworzenia kolonii służą do wykrywania wczesnych i późnych komórek progenitorowych hematopoetycznych w pierwszych dniach różnicowania, a wyniki są wyświetlane tutaj w dniu zero. Oprócz progenitorów erytroidalnych, granulocyty, progenitorzy makrofagów są znacząco reprezentowani we wczesnych komórkach CD 34 dodatnich.

W miarę postępu różnicowania liczba GM znacznie spadła, a w szóstym dniu zostały one całkowicie zastąpione przez erytroidalnych przodków, BAUE i CAUE. Ważne jest również, aby zauważyć, że od czwartego do szóstego dnia wczesne erytroidalne prekursory, BAUE, są stopniowo zastępowane przez ich bardziej zróżnicowane odpowiedniki, CAUE. Do 10 dnia komórki erytroidalne zasadniczo utraciły zdolność do tworzenia kolonii.

Pokazane tutaj są typowe zdjęcia BFUE i CFUE. Czerwono-brązowy kolor jest spowodowany hemoglobiną BFUE i CFUE. Erytropoezę monitoruje się podczas różnicowania exvivo poprzez pobieranie komórek we wskazanych punktach czasowych i analizowanie ich za pomocą faktów lub mikroskopii pod kątem ekspresji markerów powierzchni komórki.

Tutaj słupki reprezentują procenty komórek dodatnich. Istotne obserwacje obejmują postępującą utratę markera progenitorowego krwiotwórczego łodygi CD 34, postępujące nabywanie i utratę markera progenitorowego CD 36, postępujące nabywanie i utratę markera erytroidowego, progenitorowego i retikulocytów CD 71 oraz wzrost prekursora erytroidu i markera erytrocytów GPA. Inne markery różnicowania erytroidalnego obejmują syntezę hemoglobiny rozpoczynającą się w ósmym dniu, mierzoną przez barwienie benadyny i enukleację komórek rozpoczynającą się w 20 dniu.

Jak mierzy się utratą barwienia DNA LDS, wyniki transferu genów za pośrednictwem lentiwirusa w ludzkich pierwotnych pro erytroblastach są pokazane przy następnym knockucie czynnika transkrypcyjnego. T jeden był pośredniczony przez lentiwirusa dostarczonego anty T one SHRA lub zakodowany kontrolny SHRA pomiaru kinetyki poziomu transkryptu T one mRNA za pomocą RT qPCR R i ekspresji transkryptu T one w stosunku do 18. Srna wykazało, że 75% transkryptów T 1 zostało skutecznie zniszczonych w pierwotnych komórkach erytroidalnych.

Wzrost poziomu transkryptu T 1 od dnia dziewiątego do dnia 12 i zakodowana kontrola podkreśla znaczenie tego czynnika transkrypcyjnego podczas różnicowania erytroidalnego. Wreszcie, w innym eksperymencie, komórki erytroidalne zostały zakażone lentiwirusem eksprymującym białko GFP. Rysunek ten pokazuje, że trzy dni po zakażeniu większość komórek erytroidalnych wykazuje ekspresję GFP, mierzoną za pomocą fluorescencji pod mikroskopem i faktów.

Wskazuje to na skuteczność infekcji w pierwotnych komórkach erytroidalnych bliską 100% po jego rozwinięciu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się hematopoezą do zbadania regulacji transkrypcji w ludzkiej erytropoezie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak różnicować hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe w cyty w hodowli, a także jak wykorzystać dostarczanie genów za pośrednictwem lentiwirusa w celu wywołania skutecznego nokautu genów na każdym etapie tego procesu różnicowania.

Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.