Name: Analiza ilościowa przerzutów nowotworowych przy użyciu modelu zarodka ptaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-30T22:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy przerzutów nowotworowych z wykorzystaniem modelu zarodka ptaka CAM oraz PCR. Technika ta umożliwia badaczom precyzyjne badanie zdolności metastatycznych ludzkich komórek rakowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pragniemy podziękować firmie Tyson Foods Inc. za hojne przekazanie zapłodnionych jaj. Shanna Arnold wniosła istotny wkład podczas filmowania niniejszego protokołu. 
Trenis Palmer otrzymał wsparcie od National Institutes of 
Health w ramach Ruth L. Kirschstein National Research Service Award (F31 National Cancer Institute). Praca ta była częściowo finansowana z grantu CCSRI nr 700537 dla JDL 
oraz grantów NIH/NCI nr CA120711-01A1 i CA120711-01A1 dla AZ.

1. Przygotowanie jaj do ksenoprzeszczepu (przerzutów samoistnych)
<ol>
<li>Świeżo zniesione zapłodnione jaja kurze inkubuje się w inkubatorze obrotowym przez 10 dni w temperaturze 10°F i przy 60% wilgotności. Jaja są obracane cztery razy w każdej godzinie.</li>
<li>W 10. dniu rozwoju jaja umieszcza się bokiem w stojaku do jaj. Do prześwietlania jaj (kandowania) wykorzystuje się lampę z gęsim szyją lub inne odpowiednie źródło światła, kierując strumień światła przez skorupkę w tępy koniec jaja, gdzie znajduje się komora powietrzna.</li>
<li>Lokalizuje się i zaznacza żyłę chorioallantoiczną. Żyła ta znajduje się w górnej części skorupki jaja, w miejscu złączenia kilku dużych naczyń krwionośnych. W tym punkcie rozgałęzienia naczynie krwionośne opada w dół, oddalając się od CAM i przyłączając do zarodka. Ołówkiem rysuje się na skorupce jaja kwadrat o boku 1 cm, w odległości około 1 cm od punktu rozgałęzienia żyły. Obszar obejmujący kwadrat i jego okolice oczyszcza się za pomocą patyczka bawełnianego nasączonego jodyną.</li>
<li>Za pomocą obrotowego narzędzia tnącego (Dremel) z zamontowanym kamieniem szlifierskim z węglika krzemu (Dremel część nr 8492) wierci się otwór przez tępy koniec jaja do komory powietrznej. Tym samym narzędziem wierci się otwór wewnątrz wcześniej narysowanego kwadratu na górze jaja, zatrzymując się przed błoną skorupki. Do wykonania małego otworu w błonie skorupki używa się igły strzykawki o rozmiarze 25-gauge z delikatnym zadziorem na końcu, uważając, aby nie przerwać znajdującej się poniżej CAM. Następnie, w obszarze kwadratu, CAM oddziela się od błony skorupki, wykorzystując delikatne ssanie wytworzone za pomocą automatycznego pipetora z zamontowanym kawałkiem rurki Tygon o średnicy ¼”, przyłożonej do otworu w komorze powietrznej. Po zastosowaniu ssania pod otworem w kwadracie powinna powstać kieszeń powietrzna, co oznacza, że CAM została pomyślnie oddzielona od skorupki. Po oddzieleniu CAM otwór w komorze powietrznej oraz otwór w kwadracie w pobliżu żyły chorioallantoicznej uszczelnia się kawałkiem taśmy laboratoryjnej. Następnie jaja umieszcza się w inkubatorze stacjonarnym w temperaturze 10°F i przy 60% wilgotności w oczekiwaniu na przeszczepienie komórek nowotworowych. Kolejność czynności przedstawiono na rysunku 1.</li>
</ol>
2. Przygotowanie jaj do wstrzyknięcia dożylnego (metastaza eksperymentalna)
<ol>
<li>Świeżo zniesione zapłodnione jaja kurze inkubuje się w inkubatorze obrotowym przez 12 dni w temperaturze 10°F i wilgotności 60%. Jaja są obracane cztery razy w każdej godzinie.</li>
<li>W 12. dniu rozwoju jaja umieszcza się na boku w stojaku do jaj. Do prześwietlania jaj (kandlowania) wykorzystuje się lampę z gąsiej szyją lub inne odpowiednie źródło światła, kierując strumień światła przez skorupkę jaja w jego tępym końcu, gdzie znajduje się komora powietrzna.</li>
<li>Lokalizuje się i zaznacza żyłę chorioallantoiczną. Na skorupce jaja, bezpośrednio nad żyłą, rysuje się ołówkiem prostokąt o wymiarach 1 cm na 0,5 cm. Obszar wewnątrz i wokół kwadratu oczyszcza się za pomocą patyczka higienicznego nasączonego jodyną.</li>
<li>W zaznaczonym miejscu w skorupce jaja wykonuje się małe okno za pomocą wiertła Dremmel (#18). Fragment skorupki usuwa się, aby odsłonić leżącą pod nim błonę skorupową, którą następnie czyni się przezroczystą za pomocą kropli oleju mineralnego. Graficzne przedstawienie znajduje się na rysunku 5A.</li>
<li>W tym momencie otwór w komorze powietrznej oraz otwór w kwadracie w pobliżu żyły chorioallantoicznej uszczelnia się kawałkiem taśmy laboratoryjnej. Następnie jaja umieszcza się w inkubatorze stacjonarnym w temperaturze 10°F i wilgotności 60% w oczekiwaniu na wstrzyknięcie komórek nowotworowych.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek nowotworowych do przeszczepienia lub wstrzyknięcia.
<ol>
<li>W przypadku ksenoprzeszczepu komórki nowotworowe są odrywane od naczyń hodowlanych przy użyciu Trypsyny/EDTA i przemywane 10 objętościami soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), aby usunąć pozostałości pożywki, Trypsyny lub EDTA.</li>
<li>W przypadku wstrzykiwania dożylnego (I.V.), hodowane komórki są odrywane przy użyciu nieenzymatycznego roztworu do dysocjacji komórek i przemywane pożywką DMEM bez surowicy.</li> 
<li>Komórki są liczone za pomocą hemacytometru i resuspenderowane w PBS w stężeniu 10-40 milionów komórek/ml w celu przeszczepienia lub alternatywnie resuspenderowane w pożywce DMEM bez surowicy w stężeniu 1 milion komórek/ml w celu wstrzyknięcia dożylnego (I.V.).</li>
</ol>
4. Przeszczepianie komórek nowotworowych na nowo odsłoniętą błonę chalazy (CAM) (Przerzuty spontaniczne)
<ol>
<li>Jaja wyjmuje się z inkubatora i w miejscu wcześniej narysowanego kwadratu, gdzie utworzyła się nowa komora powietrzna, wycina się małe okienko. Najłatwiej wykonać to za pomocą narzędzia rotacyjnego z tarczą tnącą (narzędzie Dremel z okrągłą tarczą tnącą nr #409). Do usunięcia niewielkiego fragmentu skorupy jaja i odsłonięcia znajdującej się pod nią błony chrzęstno-płucnej (CAM) używa się pęsety z wąskimi końcami.</li>
<li>Za pomocą aplikatora z bawełnianym końcem (Fisher Brand #23-40-01) błonę CAM ściera się 5 razy. Na bawełnie powinna pojawić się niewielka ilość krwi. Natychmiast po uszkodzeniu błony CAM, na uszkodzony obszar nanosi się 25μl zawiesiny komórkowej. Optymalna liczba komórek jest ustalana empirycznie, lecz może wynosić od 0.5X105 do 1X106. Okienko w jajie szczelnie zakleja się taśmą, a jaja pozostawia się w pozycji pionowej przez 10-15 minut, aby umożliwić osiadanie komórek. Po 15 minutach jaja umieszcza się ponownie w inkubatorze stacjonarnym.</li>
<li>Guzy pozostawia się do wzrostu przez 5-8 dni, w zależności od konkretnego zastosowania i charakteru użytej linii komórek nowotworowych. Schematyczną prezentację przedstawiono na rysunku 1.</li>
</ol>
5. Dożylne wstrzyknięcie komórek nowotworowych (metastaza eksperymentalna)
<ol>
<li>Za pomocą strzykawki insulinowej o rozmiarze 30 G wżewiono 10μl zawiesiny komórek do żyły alantoicznej każdego zarodka, a następnie jaja zwrócono do inkubatora stacjonarnego, gdzie pozostały przez kolejne 1–7 dni.</li>> 
<li>W określonych punktach czasowych z każdego zarodka pobrano płuco lub dolną część błony CAM i poddano je obróbce w celu wykrycia komórek nowotworowych, zgodnie z poniższym opisem.</li>
</ol>
6. Pobieranie guzów i tkanek kurcząt
<ol>
<li>Przygotowuje się obszar do sekcji. Analiza wykrywa komórki przerzutowe poprzez ilościowe oznaczenie ludzkiego DNA przy użyciu wysoce czułej metody PCR. Dlatego bardzo ważne jest zapobieganie kontaminacji egzogennym DNA. Sekcje wykonuje się w wydzielonym obszarze, a narzędzia są czyszczone pomiędzy każdym zwierzęciem. Aby zapobiec kontaminacji krzyżowej próbek podczas procesu sekcji, stosuje się 3 oddzielne zestawy narzędzi: jeden zestaw do rozcinania jaja, jeden zestaw do usuwania guza pierwotnego i jeden zestaw do usuwania narządów wewnętrznych. Ponadto stosuje się cztery pojemniki do płukania w celu sekwencyjnego oczyszczania narzędzi między zwierzętami. Płukany są one kolejno w: 1) wodzie dwukrotnie destylowanej, 2) wodzie dwukrotnie destylowanej, 3) podchlorynie sodu i 4) 70% etanolu.</li>
<li>Jaja wyjmuje się z inkubatora stacjonarnego i umieszcza na lodzie na 15 minut w celu znieczulenia i uśmiercenia zwierząt. Otwiera się okna w skorupce tak, aby guzy stały się widoczne. Może być konieczne powiększenie okien poprzez usunięcie części skorupy jaja. Guzy pierwotne są wycinane z CAM, ważone i przekazywane do badania histologicznego.</li> 
<li>Pisklę wyjmuje się ze skorupki jaja, rozcinając ją promieniście na równe połowy. Zarodek zostaje przelany z rozciętej skorupki i przeniesiony stroną grzbietową do góry do czystej łódki wagowej. Zwierzę jest sekcjonowane przy użyciu świeżego, czystego zestawu narzędzi. Zwierzę otwiera się, przecinając mostek. Po otwarciu zarodka pobiera się fragment wątroby z prawego lub lewego płata. Następnie usuwa się narządy wewnętrzne, delikatnie pociągając za przełyk przyczepiony do żołądka mięśniowego i przecinając więzadła łączące narządy. Aby pobrać płuca, otwiera się klatkę piersiową, oddziela płytkę mostka i usuwa serce. W tym momencie można wyciąć płuca z czterech stron (górnej najbliżej głowy, lewej wzdłuż klatki piersiowej, dolnej w pobliżu przepony i prawej wzdłuż tchawicy). Dla zapewnienia spójności w każdym zwierzęciu pobiera się to samo płuco. Pobrane próbki tkanek przechowuje się w temperaturze -20°C do późniejszego użycia lub można je bezzwłocznie poddać izolacji DNA.</li>
</ol>
7. Izolacja genomowego DNA i analiza ilościową PCR
<ol>
<li>DNA genomowe jest ekstrahowane z tkanek przy użyciu zestawu Sybr Green Extract–N-Amp Tissue PCR Kit (Sigma-Aldrich nr katalogowy XNATRG). Wyekstrahowany DNA można przenieść do czystej probówki typu Eppendorf i przechowywać w temperaturze -20°C lub zużyć niezwłocznie. Przed zastosowaniem w kolejnej reakcji PCR ważne jest rozcieńczenie DNA w stosunku 1:50 w wodzie wolnej od nukleaz. Alternatywnie DNA można ekstrahować, stosując dowolny standardowy protokół ekstrakcji DNA (Zijlstra et al., 202).</li>
<li>Ludzki DNA jest wykrywany w tkankach kurczaka za pomocą ilościowego PCR specyficznego dla ludzkich sekwencji Alu. qPCR z zastosowaniem starterów specyficznych dla Alu przeprowadza się z wykorzystaniem amplifikacji SYBR green z zestawu Extract-N-Amp. Zestaw do PCR zawiera 2x mieszaninę reakcyjną zawierającą SYBR green, bufor, sole, dNTP, polimerazę Taq oraz przeciwciało Jumpstart Taq. Mieszaninę reakcyjną przygotowuje się do końcowej objętości 15μl, z zastosowaniem 0,4μM każdego startera. W większości przypadków zastosowanie wyekstrahowanego DNA rozcieńczonego 1:50 dostarczy danych ilościowych, jednak optymalna ilość DNA matrycowego może wymagać optymalizacji empirycznej. Startery do GAPDH kurczaka są wykorzystywane jako kontrola wewnętrzna. PCR dla sekwencji Alu przeprowadzany jest w następujących warunkach: aktywacja polimerazy w 95°C przez 2 min, a następnie 30 cykli: 95°C przez 30 s, 63°C przez 30 s i 72°C przez 30 s. Warunki reakcji dla GAPDH kurczaka są identyczne z opisanymi dla Alu, jednak konieczne może być wydłużenie PCR do 40 cykli.</li>
<li>Ilościowa analiza przerzutowania jest przeprowadzana metodą ΔΔCt poprzez porównanie grup eksperymentalnych z grupą kontrolną (Schmittgen and Livak, 2008; Zijlstra et al., 202). Alternatywnie można wygenerować krzywą wzorcową, stosując szereg rozcieńczeń ludzkich komórek nowotworowych wyekstrahowanych za pomocą zestawu Extract-N-Amp (Zijlstra et al., 202). Istotność statystyczną ocenia się za pomocą testu t Studenta lub analizy ANOVA dla grup kontrolnych i eksperymentalnych.</li> 
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig1.jpg" alt="Badanie guza zarodka kurczaka z wykorzystaniem testu CAM, schemat i zdjęcia metody oraz etapów pobierania próbek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rys. 1. Model przerzutów w zarodku kurzym. A) Schemat składający się z czterech paneli, ilustrujący wygląd modelu w przekroju na kluczowych etapach: 1. Po 10 dniach inkubacji. Błona chalazowa (CAM) osiągnęła rozmiar bliski maksymalnemu. Tętnice i żyły są wyraźnie widoczne, a żyła alantoiczna jest ułożona przy górnej części jaja. 2. Jajo bezpośrednio po wykonaniu dwóch otworów w skorupce: jednego w komorze powietrznej, a drugiego w pobliżu punktu przyczepu żyły alantoicznej. 3. Wygląd po zastosowaniu lekkiej próżni w celu opróżnienia komory powietrznej i opuszczenia błony CAM. Komórki nowotworowe (kolor niebieski) zostają naniesione na opuszczoną błonę CAM. 4. Po umożliwieniu wzrostu wszczepionych komórek nowotworowych, guz wraz z tkankami zarodka kurczego zostaje pobrany do analizy. B) Schematyczna przedstawienie modelu: 1. Inkubacja jaj. 2. Wyznaczenie lokalizacji żyły alantoicznej. 3. Wywiercenie otworów w skorupce jaja. 4. Odsłonięcie błony CAM. 5. Wycięcie otworu do przeszczepienia komórek nowotworowych. 6. Aplikacja komórek nowotworowych. 7. Chłodzenie jaj na lodzie przed pobraniem tkanki. 8. Pobranie guza po 7 dniach wzrostu.
<img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig2.jpg" alt="Analiza mikroskopowa tkanek nowotworowych; preparaty histologiczne; powiększenia od 10X do 20X; zrąb, martwica." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Histologia guzów CAM. Tkanki pobrane z błony kosmowo-owocniowej z przerostem guza utrwalono w formalinie, pocięto i poddano barwieniu trójskładnikowemu. A) Guz HEp3 po siedmiu dniach wzrostu na CAM. B i C przedstawiają powiększone obszary z obrazu A, ukazujące zarówno guz, jak i zręb. D) Prawidłowa błona CAM.
<img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig3.jpg" alt="Wykres słupkowy danych dotyczących przerzutowania; porównanie liczby komórek HEp3 w ciągu 7 dni; wysoki/niski potencjał przerzutowy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Ilościowa analiza podłużna przerzutówWarianty linii komórkowej raka głowy i szyi HEp3 o wysokim lub niskim potencjale przerzutowym (odpowiednio HEp3 M(High) i HEp3 M(Low)) przeanalizowano pod kątem zdolności do rozsiewania za pomocą metody Alu PCR. W każdym punkcie czasowym w ciągu 7 dni analizowano dziesięć zwierząt. Próbki te skwantyfikowano w odniesieniu do krzywej wzorcowej, a następnie wyrażono jako liczbę komórek na 50 mg tkanki.
<img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig4.jpg" alt="Wykres pudełkowy porównania poziomu przerzutów (ΔCt) pomiędzy grupami HEp3 Control i HEp3 +1A5." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Hamowanie spontanicznej przerzutowości komórek u zwierząt leczonych przeciwciałem 1A5 hamującym przerzutowanieGuzy utworzono przy użyciu 5x105 Komórki HEp3 naniesiono na błonę żółtkową (CAM) zarodków w 10. dniu inkubacji. Trzy dni po naniesieniu komórek nowotworowych połowę zwierząt poddano leczeniu przeciwciałem anty-CD151 1A5. Płuca zwierząt z nowotworem pobrano dwa dni później i poddano ilościowej analizie qPCR dla sekwencji alu. W przeciwieństwie do tego, ilościowe qPCR dla chGAPDH wykorzystano w celu potwierdzenia obecności równoważnych ilości genomowego DNA gospodarza. Do ilościowego porównania obu grup zastosowano metodę ΔΔCt (B).
<img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig5.jpg" alt="Analiza danych dotyczących zatrzymania i wzrostu przerzutowego; wykres słupkowy, schemat CAM, badanie intrawazacji komórek nowotworowych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Ocena zatrzymania, wzrostu i intrawazacji w kaskadzie przerzutniczejZasadniczo przerzut do narządu wtórnego jest definiowany przez wpływ trzech aspektów: zatrzymania, szybkości wzrostu oraz szybkości intrawasacji. Można je określić ilościowo, wykorzystując kombinację przerzutów eksperymentalnych (A) i przerzutów spontanicznych (B). W przypadku przerzutów eksperymentalnych (A) zatrzymanie definiuje się jako liczbę komórek wykrytych 2 godziny po iniekcji. Przeżywalność i wzrost zatrzymanych komórek określa się jako zmianę liczby komórek 24 godziny po iniekcji. Wzrost definiuje się jako tempo proliferacji w dniach 3–7. Intrawasację określa się za pomocą przerzutów spontanicznych (B), gdzie liczba komórek, które uległy intrawasacji, jest definiowana jako obciążenie przerzutowe obecne w 7. dniu, które przekracza wartość przewidzianą na podstawie wzrostu obciążenia przerzutowego obecnego w 6. dniu.
<img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig6.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna, rośliny naczyniowe; porównanie wzrostu w 1., 3. i 5. dniu; eksperyment kontrolny." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Wizualizacja rozprzestrzeniania się przerzutów w błonie chalazowej (CAM)Komórki HEp3 wykazujące ekspresję GFP wstrzyknięto dożylnie w 12. dniu rozwoju. W 1., 3. i 5. dobie poświęcono zarodek i wykonano obrazowanie fragmentu błony chalazowej (CAM) przy użyciu fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego. Ciemnozielone tło jest wynikiem obecności skorupy jaja, unaczynienie jest widoczne jako czarne linie, a komórki nowotworowe jako jasnozielone punkty.

<ol><li>Ghiso, A. guirre, Kovalski, J. A., K,, Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+dormancy+induced+by+downregulation+of+urokinase+receptor+in+human+carcinoma+involves+integrin+and+MAPK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling.</a> J Cell Biol. 147, 89-104 (1999).</li>
<li>Chambers, A. F., Shafir, R., Ling, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+system+for+studying+metastasis+using+the+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">A model system for studying metastasis using the embryonic chick.</a> Cancer research. 42, 4018-4025 (1982).</li>
<li>Chambers, A. F., Wilson, S. M., Tuck, A. B., Denhardt, G. H., Cairncross, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+metastatic+properties+of+a+variety+of+mouse%2C+rat%2C+and+human+cells+in+assays+in+nude+mice+and+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Comparison of metastatic properties of a variety of mouse, rat, and human cells in assays in nude mice and chick embryos.</a> In Vivo. 4, 215-219 (1990).</li>
<li>Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+effect+of+matrix+metalloproteinase+down-regulation+on+vascular+intravasation+and+metastasis+of+human+fibrosarcoma+cells+selected+in+vivo+for+high+rates+of+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination.</a> Cancer Res. 65, 10959-10969 (2005).</li>
<li>Hahn-Dantona, E., Ramos-DeSimone, N., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+proMMP-9+by+a+plasmin%2FMMP-3+cascade+in+a+tumor+cell+model.+Regulation+by+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Activation of proMMP-9 by a plasmin/MMP-3 cascade in a tumor cell model. Regulation by tissue inhibitors of metalloproteinases.</a> Ann N Y Acad Sci. 878, 372-387 (1999).</li>
<li>Kim, J., Yu, W., Kovalski, K., Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+specific+proteases+in+cancer+cell+intravasation+as+revealed+by+a+novel+semiquantitative+PCR-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay.</a> Cell. 94, 353-362 (1998).</li>
<li>Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+embryonic+and+tumor+neovasculature+using+viral+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles.</a> Nat Protoc. 5, 1406-1417 (2010).</li>
<li>Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+nanoparticles+as+tools+for+intravital+vascular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging.</a> Nat Med. 12, 354-360 (2006).</li>
<li>Ossowski, L., Reich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+malignant+phenotype+of+a+human+carcinoma+conditioned+by+growth+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Changes in malignant phenotype of a human carcinoma conditioned by growth environment.</a> Cell. 33, 323-333 (1983).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3, 1101-1108 (2008).</li>
<li>Testa, J. E., Brooks, P. C., Lin, J. M., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+expression+cloning+with+an+antimetastatic+monoclonal+antibody+identifies+a+tetraspanin+%28PETA-3%2FCD151%29+as+an+effector+of+human+tumor+cell+migration+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic expression cloning with an antimetastatic monoclonal antibody identifies a tetraspanin (PETA-3/CD151) as an effector of human tumor cell migration and metastasis.</a> Cancer Res. 59, 3812-3820 (1999).</li>
<li>Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Inhibition+of+Tumor+Cell+Intravasation+and+Subsequent+Metastasis+via+Regulation+of+In+Vivo+Tumor+Cell+Motility+by+the+Tetraspanin+CD151%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The Inhibition of Tumor Cell Intravasation and Subsequent Metastasis via Regulation of In Vivo Tumor Cell Motility by the Tetraspanin CD151.</a> Cancer Cell. 13, 221-234 (2008).</li>
<li>Zijlstra, A., Mellor, R., Panzarella, G., Aimes, R. T., Hooper, J. D., Marchenko, N. D., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+rate-limiting+steps+in+the+metastatic+cascade+using+human-specific+real-time+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of rate-limiting steps in the metastatic cascade using human-specific real-time polymerase chain reaction.</a> Cancer Res. 62, 7083-7092 (2002).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Błona chorioallantoiczna (CAM) kurczęcia jest od dziesięcioleci wykorzystywana jako modelowy system do badania różnych aspektów biologii nowotworów i progresji przerzutowej. Główne oceny zdolności do tworzenia przerzutów w tym modelu były przeprowadzane przez wiele grup badawczych, obejmując analizę stanu uśpienia (Aguirre Ghiso et al., 1999; Ossowski and Reich, 1983), przebudowy tkanek (Deryugina et al., 2005; Hahn-Dantona et al., 1999) oraz przerzutowania (Zijlstra et al., 2008; Zijl...

<table><tbody><tr><td>1X Dulbecco&amp;rsquo;pożywka DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Invitrogen</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;roztwór soli fosforanowo-buforowej (D-PBS) (1X), ciecz</td><td>Invitrogen</td><td>14190250</td><td>pH 7,4</td></tr><tr><td>Trypsyna, 0,05% (1X) z EDTA 4Na, roztwór</td><td>Invitrogen</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator Sportsman</td><td>Berry Hill</td><td>1550HA</td><td>Inkubatory te należą do najłatwiej dostępnych. Jednakże w materiale wideo zaprezentowano inny sprzęt.</td></tr><tr><td>Inkubator dla sportowców </td><td>Berry Hill</td><td>1502EA</td><td>Inkubatory te należą do najpowszechniej dostępnych. W materiale wideo zaprezentowane zostanie jednak inne wyposażenie.</td></tr><tr><td>narzędzie rotacyjne Dremel</td><td>Dremel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tarcze odcinające Dremel nr 36 </td><td>Dremel</td><td>409</td><td></td></tr><tr><td>Przenośny pipetator elektroniczny</td><td>Fisher Scientific</td><td>1368115E</td><td></td></tr><tr><td>Patyczki z bawełnianym końcem</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-001)</td><td></td></tr><tr><td>Zapłodnione jaja</td><td>Różnorodne</td><td></td><td>Można korzystać z produktów wielu różnych dostawców. Jaja powinny ważyć około 35–55 g. Kury, które je znoszą, powinny być w wieku od 36 do 55 tygodni.</td></tr><tr><td>Komora Licznikowa (Hemocytometr)</td><td>Hausser Scientific</td><td>15170-090</td><td></td></tr><tr><td>Iluminator światłowodowy do mikroskopu</td><td>Amscope</td><td>HL250-AY</td><td>150 W</td></tr><tr><td>igła 25 G</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt Sybr Green&amp;mdash;Zestaw do PCR z tkanek N-Amp</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>XNATRG</td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowa analiza przerzutów nowotworowych z wykorzystaniem modelu zarodka ptaka

Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

W trakcie przerzutowania komórki nowotworowe odrywają się od guza pierwotnego, naciekają sąsiednie tkanki i rozprzestrzeniają się do odległych narządów. Przerzutowanie jest złożonym procesem, który może angażować wiele typów tkanek, trwać w zmiennych przedziałach czasowych i często zachodzić głęboko w narządach, co utrudnia jego badanie i kwantyfikację. Ponadto na skuteczność procesu przerzutowania wpływa wiele etapów kaskady przerzutniczej, co utrudnia ocenę wkładu pojedynczego aspektu zachowania komórek nowotworowych. W konsekwencji testy przerzutowania są często przeprowadzane na zwierzętach doświadczalnych, aby zapewnić niezbędny, realistyczny kontekst do badania tego zjawiska. Niestety, modele te są dodatkowo komplikowane przez złożoną fizjologię organizmów. Zarodek piszczaka jest unikalnym modelem in vivo, który pokonuje wiele ograniczeń w badaniu przerzutowania dzięki dostępności błony chorioallantoicznej (CAM) – dobrze unaczynionej tkanki pozazarodkowej znajdującej się pod skorupą jaja, która jest podatna na ksenoprzeszczepy komórek nowotworowych (rycina 1). Co więcej, ponieważ zarodek piszczaka jest naturalnie immunodeficientny, CAM łatwo wspomaga przyjmowanie zarówno tkanek prawidłowych, jak i nowotworowych. Co najważniejsze, ptasia błona CAM pomyślnie wspiera większość cech komórek rakowych, w tym wzrost, inwazję, angiogenezę oraz przebudowę mikrośrodowiska. Dzięki temu model ten jest wyjątkowo użyteczny w badaniu szlaków prowadzących do przerzutowania nowotworów oraz w przewidywaniu odpowiedzi przerzutowego raka na nowe potencjalne terapie. Wykrywanie rozproszonych komórek za pomocą gatunkowo specyficznej metody Alu PCR umożliwia ilościową ocenę przerzutowania w narządach skolonizowanych przez zaledwie 25 komórek. Wykorzystując linię komórkową raka naskórkowego człowieka (HEp3), używamy tego modelu do analizy spontanicznych przerzutów komórek nowotworowych do odległych narządów, w tym do wątroby i płuc piszczaka. Ponadto, stosując protokół Alu-PCR, demonstrujemy czułość i powtarzalność tej metody jako narzędzia do analizy i kwantyfikacji intrawazacji, zatrzymania, ekstrawazacji oraz kolonizacji jako poszczególnych elementów przerzutowania.

Wykorzystując ilościową PCR, demonstrujemy, w jaki sposób uznany model CAM kurczaka może być użyty do ilościowej analizy przerzutowania ludzkich komórek nowotworowych do odległych narządów.

Ilościowa analiza przerzutów nowotworowych z wykorzystaniem modelu zarodka ptaka

Podczas przerzutowania komórki nowotworowe odrywają się od guza pierwotnego, naciekają sąsiadujące tkanki i rozprzestrzeniają się do odległych narządów. Przerzutowanie jest złożonym...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowa ocena zdolności przerzutniczej komórek nowotworowych z wykorzystaniem błony żółtkowej (CAM) jako modelu ksenoprzeszczepu. Osiąga się to poprzez inkubację zapłodnionych jaj do momentu pełnego rozwoju błony CAM, a następnie poprzez dożylne wstrzyknięcie lub miejscowy ksenoprzeszczep komórek nowotworowych do błony CAM.Po eksperymentalnie określonym odstępie czasu pobiera się tkankę do analizy, następnie ilościowo określa się przerzuty, wykorzystując specyficzny dla ludzi test PCR w celu wykrycia sekwencji allelu ludzkiego, a następnie analizuje się wyniki. Nazywam się Trent Palmer. Jestem doktorantem w laboratorium dr. Andre Zilstry.Zademonstruję model ksenoprzeszczepu oraz model przerzutów spontanicznych, natomiast mój mentor, dr Zilstra, zaprezentuje wstrzyknięcie dożylne oraz model przerzutów eksperymentalnych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi modelami jest szybkość i łatwość, z jaką badacz może przeprowadzić ilościowe badania przerzutów ludzkich komórek nowotworowych; eksperymentatorzy mogą przygotować około 120 zwierząt i zrealizować cały protokół od początku do końca w ciągu dwóch tygodni.Ze względu na dostę

quantitative-analysis-of-cancer-metastasis-using-an-avian-embryo-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ilościowa analiza przerzutów nowotworowych z wykorzystaniem modelu zarodkowego ptaka

Ten film opisuje metodę mikroiniekcji do dostarczania komórek raka piersi do przestrzeni okołobiałkowej transgenicznych embrionów danio pręgowanego. Po inkubacji wizualizujemy zarodek pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby obserwować inwazję, rozprzestrzenianie się i przerzuty komórek rakowych.

Analiza inwazyjności zPDX: badanie inwazyjnego zachowania przerzutowych komórek rakowych w ksenoprzeszczepach zarodków danio pręgowanego

W tym filmie opisujemy wszczepianie komórek rakowych na błonę kosmówkowo-omoczniową kurczaka w celu wygenerowania modelu in ovo. Model z powodzeniem wszczepia komórki raka jajnika w celu zbadania progresji raka ginekologicznego.

Modelowanie raka błony moczowo-omoczniowej kurczaka: model in ovo do badania nowotworzenia i przerzutów komórek rakowych

Ten film demonstruje procedurę dożylnego wstrzykiwania komórek rakowych do naczyń krwionośnych błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka w celu wygenerowania modelu przerzutów raka CAM. Wstrzyknięte komórki ostatecznie tworzą rozproszone kolonie pojedynczych komórek nowotworowych, co pozwala na badanie inwazji raka i przerzutów.

Dożylne wstrzyknięcie komórek rakowych do naczyń błony moczowo-omoczniowej kurczaka: procedura mająca na celu ustalenie modelu raka błony moczowo-omoczniowej w celu zbadania inwazji raka i przerzutów

Tutaj, monitorowanie metabolizmu komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym, w połączeniu z modelem przerzutów in vivo błony kosmówkowo-omocznikowej (CAM) zarodka kurczaka, są wykorzystywane do oceny nowych celów/środków przeciwnowotworowych pod kątem ich zdolności do uwrażliwiania komórek nowotworowych na chemoterapeutyki uszkadzające DNA.

Ocena skuteczności uczulenia na leki przeciwnowotworowe in vitro i in vivo

Tutaj opisujemy modele ksenoprzeszczepu danio pręgowanego za pomocą dwóch różnych miejsc iniekcji, tj. przestrzeni perivitelinowej i kanału Cuviera, aby zbadać inwazyjne zachowanie i ocenić potencjał wewnątrznaczyniowy i wynaczynieniowy ludzkich komórek raka piersi, odpowiednio.

Inwazyjne zachowanie ludzkich komórek raka piersi u embrionalnego danio pręgowanego

Rak jasnokomórkowy nerki z przerzutami jest chorobą, która nie posiada kompleksowego modelu zwierzęcego do dokładnych badań przedklinicznych. Protokół ten ilustruje dwa nowatorskie modele zwierzęce choroby: ortotopowo wszczepiony model myszy i model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka, z których oba wykazują przerzuty do płuc przypominające przypadki kliniczne.

Porównanie modelu przerzutowego raka jasnokomórkowego nerki ustalonej w nerce myszy i na błonie kosmówkowo-omoczniowej kurczaka

Prezentujemy model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka jako alternatywny, nadający się do przeszczepu, model in vivo do wszczepiania ginekologicznych i urologicznych linii komórkowych raka oraz guzów pochodzących od pacjentów.

Wykorzystanie błony chorio-omoczniowej kurczaka w modelu in vivo do badania nowotworów ginekologicznych i urologicznych

Opisane podejście łączy eksperymentalne testy przerzutów do żył ogonowych z obrazowaniem żywych zwierząt in vivo, aby umożliwić monitorowanie w czasie rzeczywistym powstawania i wzrostu przerzutów raka piersi, a także ilościowe określenie liczby i wielkości przerzutów w płucach.

Łączne wykorzystanie testów przerzutów do żył ogonowych i obrazowania in vivo w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia kolonizacji przerzutowej raka piersi i obciążenia płuc

Dożylne wstrzykiwanie komórek rakowych jest często stosowane w badaniach nad przerzutami, ale obciążenie guzem przerzutowym może być trudne do analizy. W tym artykule demonstrujemy model przerzutów do iniekcji żyły ogonowej i uwzględniamy nowatorskie podejście do analizy wynikającego z przerzutowego obciążenia guzem płuc.

Analiza patologiczna przerzutów do płuc po bocznym wstrzyknięciu komórek nowotworowych do żyły ogonowej

To jest skuteczna metoda do wykrywania supresorów lub czynników powodujących przerzuty raka. Komórki, transdukowane biblioteką ekspresji, są wstrzykiwane do układu naczyniowego błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka w celu utworzenia kolonii przerzutowych. Kolonie o zmniejszonej lub zwiększonej inwazyjności są wycinane, namnażane, ponownie wstrzykiwane w celu potwierdzenia ich fenotypu, a na koniec analizowane przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.

Odkrycie regulatorów przerzutów przy użyciu szybkiego i ilościowego modelu błony nazębiowej przyżyciowej kurcząt

Test CAM-Delam do oceny zdolności przerzutowej komórek nowotworowych jest stosunkowo szybki, łatwy i tani. Metoda ta może być stosowana do odkrywania mechanizmów molekularnych regulujących powstawanie przerzutów oraz do badań przesiewowych leków. Zoptymalizowany test do analizy próbek ludzkich nowotworów może być metodą kliniczną spersonalizowanego leczenia raka.

Test CAM-Delam w celu oceny właściwości przerzutowych poprzez ilościowe określenie zdolności delaminacji i inwazji komórek nowotworowych

Poznaj metodę ilościowej analizy przerzutów nowotworowych z wykorzystaniem modelu zarodka ptaka CAM oraz PCR. Technika ta umożliwia badaczom precyzyjne badanie zdolności metastatycznych ludzkich komórek rakowych.

Ilościowa analiza przerzutów nowotworowych z wykorzystaniem modelu zarodka ptaka

Przeglądaj więcej filmów