Name: Mysz Cremaster Preparat mięśniowy do przyżyciowego obrazowania mikrokrążenia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Poznaj metodę przygotowania mięśnia kremasterowego myszy do przyżyciowego obrazowania mikrokrążenia. Technika ta umożliwia badanie regulacji przepływu krwi i dostarczania tlenu na poziomie komórkowym w układzie naczyniowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania w laboratorium autorów są wspierane przez granty Narodowych Instytutów Zdrowia (National Institutes of Health) R37-HL041026, R01-HL086483 oraz R01-HL056786 (SSS) a także przez F32-HL097463 i T32-AR048523 (PB) z Publicznej Służby Zdrowia Stanów Zjednoczonych (United States Public Health Service).

1. Podkładka dla myszy, piedestał mięśniowy, klin pod ciało i roztwór do superfuzji
<ol>
 <li>Podkładka dla myszy: Przezroczysta prostokątna płyta z pleksiglasu (szerokość 6", długość 8", grubość 3/16") wykonana tak, aby pasowała do stolika mikroskopu. Na tej „podkładce dla myszy” unieruchamia się znieczuloną mysz podczas chirurgicznego przygotowania mięśnia kremaster. </li>
 <li>Podstawka pod mięsień: Przezroczysta silastykowa gumowa podstawka jest przygotowywana z Sylgard 184, który należy zmieszać zgodnie z instrukcją producenta°zgodnie z instrukcją. Wygodną formą jest jednorazowa szalka Petri o grubości 15 mm i średnicy 50 mm. Blok Sylgardu jest przycinany do pożądanego kształtu za pomocą żyletki (patrz Rycina 1C.). Do przymocowania bloku Sylgardu do płytki dla myszy używa się cienkiej warstwy bezbarwnego, wodoodpornego kleju silikonowego. Przydatne wskazówki: Po wlaniu Sylgardu do szalki Petri, odgazowanie w komorze próżniowej przez godzinę usuwa pęcherzyki powietrza i poprawia przejrzystość. Po odgazowaniu czas utwardzania Sylgardu ulega skróceniu poprzez umieszczenie szalki w piecu laboratoryjnym w temperaturze 50 °C przez kilka godzin.</li>
 <li>Klin pod ciało i platforma grzewcza: Klin (2" x 4" x 15°) umieszczony pod myszą i oparty o postument pochyla ciało zwierzęcia do przodu, co ułatwia wyciągnięcie mięśnia kremastra nad postument od strony jego przyczepu. Zastosowanie aluminiowej platformy na powierzchni zapewnia przewodzenie ciepła. Platforma jest ogrzewana przez rezystory podłączone do zasilacza prądu stałego (Rycina 1A). Kalibracja temperatury platformy do ˜40 °C utrzymuje temperaturę przełyku na poziomie ˜37 °CW przeciwnym razie wykorzystuje się ciepło promieniujące z lampy.</li>
 <li>Szpilki. W celu unieruchomienia mięśnia kremastra na podstawce przygotowuje się szpilki z igieł entomologicznych o średnicy 0,15 mm, zgiętych w kształt litery „L”.</li>
 <li>Fizjologiczny roztwór soli (PSS). Preparaty są stale superfuzowane (przemywane) PSS z buforem wodorowęglanowym, przygotowanym w wodzie ultrapurej (18,2 MΩ) H2O. Roztwory zapasowe przygotowuje się w 20-krotnym stężeniu roboczym i sterylizuje za pomocą 0.2 μm filtrować. Roztwory zapasowe pozostają stabilne przez kilka tygodni podczas przechowywania w 4°CPrzygotowanie soli oddzielnie od wodorowęglanu i ich mieszanie z rozcieńczeniem w dniu eksperymentu zapobiega wytrącaniu się wodorowęglanu wapnia. Roztwór soli zapasowy składa się z (w mmol/L): 2638 NaCl, 94 KCl, 40 MgSO44, 23,4 CaCl2Roztwór zapasu wodorowęglanów zawiera 360 NaHCO33W dniu przeprowadzenia eksperymentu odpowiednie roztwory doprowadza się do objętości końcowej (zazwyczaj 2 l dla danego eksperymentu) w kolbie miarowej, a następnie umieszcza w łaźni wodnej o temperaturze ok.37°CRównoważenie PSS z 5% CO22 / 95% N2 przez około 15 minut przy użyciu dyspergera gazowego, co pozwala dostosować pH do poziomu około 7,4 i zapobiega precypitacji. Przez PSS stale przepływa 5% CO22 / 95% N2 przez cały czas trwania eksperymentów. Końcowy skład roztworu roboczego (w mmol/L) to: 132 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgSO44, 2 CaCl22, 18 NaHCO33.</li>
</ol>
2. Znieczulenie i przygotowanie do operacji
<ol>
 <li>Po uzyskaniu zgody Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt wykorzystuje się samce myszy w wieku co najmniej 12 tygodni. Mysz jest znieczulana pentobarbitalem sodowym (60 mg/kg) poprzez wstrzyknięcie domięśniowe (i.p.). Do unieruchomienia myszy podczas pierwszej iniekcji przydatna jest rurka ograniczająca. W trakcie procedur chirurgicznych i protokołów eksperymentalnych znieczulenie podtrzymuje się za pomocą dawek uzupełniających (10-20% dawki początkowej, i.p.) w razie potrzeby (co 30-60 minut; wskazuje na to reakcja wycofania po uciśnięciu palca u stopy lub ogona). Wskazówka: Rozcieńczenie pentobarbitalu do stężenia 10 mg/ml w sterylnym roztworze soli fizjologicznej przed wstrzyknięciem zmniejsza ryzyko przedawkowania.</li>
 <li>Znieczulenie upośledza regulację temperatury, dlatego mysz musi być utrzymywana w cieple natychmiast po pierwszej iniekcji. Skuteczne jest umieszczenie myszy w metalowym transporterze (wentylowanym koszyku aluminiowym) na płycie grzewczej (skalibrowanej na ˜37 °C). Alternatywnie można użyć lampy grzewczej, dbając o jej umieszczenie w odpowiedniej odległości od myszy. Stan myszy należy monitorować co 5-10 minut, aż do osiągnięcia odpowiedniego poziomu znieczulenia (brak reakcji wycofania po uciśnięciu palca u stopy lub ogona). Po 15-20 minutach może być wymagana dawka uzupełniająca. Najlepiej zachować cierpliwość i ostrożność, aby uniknąć przedawkowania, zwłaszcza w przypadku zwierząt otyłych lub starszych.</li>
 <li>Włosy z dolnej części brzucha, dolnej części pleców, moszny i nóg usuwa się poprzez ostrożne ogolenie odpowiednich obszarów. Należy zwrócić szczególną uwagę, aby nie uszkodzić moszny i jąder, co w przeciwnym razie spowodowałoby uraz mięśnia opuszkowego. Luźne włosy należy usunąć świeżym gazikiem nasączonym alkoholem.</li>
 <li>Jeśli pęcherz jest pełny, będzie wyczuwalny przez ścianę brzucha jako mała winogrona. Opróżnij pęcherz, wywierając delikatny nacisk, aby zapobiec oddawaniu moczu przez mysz na preparat mięśnia opuszkowego podczas eksperymentów. Do zbierania moczu efektywną gąbką jest chusteczka Kimwipe.</li>
 <li>Ułóż mysz na plecach, opierając ją o klin, tak aby nogi obejmowały postument. Sznur jedwabny (4-0 lub 5-0) przywiązany do każdej stopy służy jako wiązadło do zabezpieczenia myszy kroczem przy postumencie. Kawałek taśmy luźno położony na klatce piersiowej i przymocowany do klina utrzymuje ogólną pozycję ciała. Procedury chirurgiczne wykonuje się przy użyciu stereomikroskopu, korzystając z nożyczek do mikrodysekcji i pęsety kątowej.</li>
</ol>
3. Chirurgiczne przygotowanie otwartego mięśnia kremaster
<ol>
 <li>Przez wierzchołek worka mosznowego (lewy lub prawy) wprowadza się szpilkę i mocuje ją w podeście, aby napiąć skórę. Nad polem operacyjnym rozpoczyna się superfuzję roztworem PSS (34-35 °C), którą kontynuuje się przez cały czas trwania sekcji, aby utrzymać odsłoniętą tkankę w cieple i wilgoci. Knot (wykonany z Kimwipe), którego jeden koniec znajduje się obok worka mosznowego, a drugi przy linii próżniowej, odprowadza odpływający PSS. Kropla uszczelniacza silikonowego przyklejona do płyty z pleksiglasu i całkowicie otaczająca klin oraz podest służy jako „fosy” do zbierania każdego PSS, który nie zostanie odessany, stanowiąc skuteczną ostrożność w celu zapobiegania wyciekowi PSS na mikroskop.</li>
 <li>Wykonuje się nacięcie wzdłuż brzusznej powierzchni worka mosznowego. Jeśli jądro zostało wciągnięte przez mięsień opuszkowy do jamy brzusznej, delikatny nacisk na dolną część brzucha kieruje jądro do worka. Należy w tym momencie zidentyfikować powierzchnię mięśnia opuszkowego pokrywającego jądro. Tkankę łączną pomiędzy skórą moszny a mięśniem opuszkowym ostrożnie usuwa się, aby uwolnić mięsień opuszkowy z otaczających go tkanek.</li>
 <li>Skórę moszny delikatnie odsuwa się za proksymalną krawędź podstawy i mocuje po obu stronach szpilkami. Następnie z zewnętrznej powierzchni mięśnia opuszkowego usuwa się tkankę łączną. Ciągła superfuzja podczas sekcji nawadnia tkankę łączną, co ułatwia jej widoczność i usunięcie.</li>
 <li>Szpilkę wprowadzoną przez wierzchołek mięśnia opuszkowego wykorzystuje się do jego napięcia wzdłuż. Wykonuje się nacięcie podłużne przez brzuszna powierzchnię mięśnia, zachowując szczególną ostrożność, aby zminimalizować uszkodzenie naczyń krwionośnych. Dynamika przepływu krwi w pobliżu obwodu preparatu ulega zmianie w wyniku tego uszkodzenia tkanek14. Dlatego, aby zminimalizować te wpływy na gromadzenie danych, do obrazowania i badań fizjologicznych wykorzystuje się naczynia krwionośne znajdujące się blisko centrum preparatu.</li>
 <li>Mięsień opuszkowy jest połączony cienką więzadłem z najduszką znajdującą się pod jądrem. Odsuniecie jądra na jedną stronę odsłania to więzadło, które ostrożnie oddziela się od najduszki. W pobliżu wierzchołka mięśnia opuszkowego znajduje się mała tętnica i żyła łączące go z najduszką. Okluzyjne zamknięcie tych naczyń między pincetami i ich rozdzielenie minimalizuje krwawienie. Jądro, najduszka, tętnica i żyła jądrzowa zostają podwiązane proksymalnie (szew jedwabny 4-0 lub 5-0), przecięte i usunięte (orchiektomia) wraz z powiązaną tkanką tłuszczową pachwinową. Alternatywnie jądro można delikatnie przesunąć z powrotem do jamy brzusznej i utrzymać za pomocą kawałka waty lub Kimwipe. Orchiektomia służy uniknięciu możliwego urazu tkanek podczas wpychania jąder z powrotem do jamy brzusznej. Nie stwierdzono zauważalnych różnic w jakości preparatu mikrokrążenia mięśnia opuszkowego (patrz Sekcja 3.8) przy zastosowaniu którejkolwiek z tych procedur7,15.</li>
 <li>Z zewnętrznej powierzchni mięśnia opuszkowego usuwa się pozostałą tkankę łączną, a następnie rozkłada się go promieniście na powierzchni podstawy. Krawędzie mocuje się szpilkami (patrz Sekcja 1.4) w 5-6 miejscach, aby utworzyć płaski płat mięśnia prążkowanego z nienaruszoną mikrokrążeniem.</li>
 <li>Gotowy preparat przenosi się na stolik mikroskopu intravitalnego, poddaje ciągłej superfuzji (3-5 ml/min, 34 °C) i equilibracji przez 30 minut.</li>
 <li>Integralność preparatu z mięśnia opuszkowego ocenia się według kilku kryteriów. Spontaniczny ton naczynioruchowy przy minimalnym urazie chirurgicznym jest wskazywany przez szybki przepływ w arteriolach i brak adherentnych leukocytów w wenulach. Najbardziej czułym wskaźnikiem responsywnego preparatu jest skurcz arteriol po zwiększeniu zawartości tlenu w roztworze do superfuzji przez 5-10 minut. Odbywa się to poprzez equilibrację z 21% O2 (wobec 5% O2; patrz Sekcja 1.5; wszystko z 5% CO2, reszta N2). Obecność leukocytów w arteriolach, brak erytrocytów przepływających przez kapilary i/lub gromadzenie się leukocytów w wenulach i otaczających tkankach są oznakami uszkodzenia tkanek i stanu zapalnego.</li>
</ol>
4. Obrazowanie intravitalne mikrokrążenia mięśnia kremaster
<ol>
 <li>Obrazowanie intravitalne jest przeprowadzane przy użyciu specjalistycznego mikroskopu opartego na platformie Olympus MVX10 Stereo Zoom. Korpus mikroskopu MVX10 jest zamontowany na hybrydowym statywie MVX10 wyposażonym w oświetlenie przechodzące (lampy halogenowej) do obrazowania w polu jasnym (Köhlera) oraz w oświetlenie epifokalne (lampy rtęciowej) do obrazowania fluorescencyjnego. Przy zastosowaniu oświetlenia epifokalnego GCaMP2 jest wzbudzany przy 472/30 nm, a emisja jest zbierana przy 520/35 nm. Obrazy są pozyskiwane przez obiektyw MV PLAPO 2XC (apertura numeryczna = 0.50; Olympus) przy użyciu wzmocnionej kamery cyfrowej XR/Mega-10 (Stanford Photonics, Inc.; SPI) za pomocą oprogramowania Piper Control Software (SPI) na komputerze osobistym. W tym systemie obserwowany obszar widzenia (FOV) może być zmienny w zakresie od 53 μm X 442 μm do 2 mm X 18 mm.</li>
 <li>Po zakończeniu eksperymentów z obrazowaniem intravitalnym zależączona mysz jest poddawana eutanazji poprzez przedawkowanie pentobarbitalu, a następnie zwichnięcie szyi.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig1.jpg" alt="Równowaga statyczna; ΣFx=0; urządzenie na płaszczyźnie nachylonej; układ doświadczalny; demonstracja analizy sił" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Podkładka dla myszy do obrazowania intravitalnego preparatu mięśnia kremaster myszy. A) Klin pod ciało z platformą aluminiową (izolowaną żółtym tworzywem sztucznym) widziany od dołu. Grzałki przymocowane do spodu platformy zapewniają ciepło przewodzone. B) Platforma grzewcza spoczywa na plastikowym klinie. C) Klin pod ciało umieszczony jest na płycie z pleksiglasu do przeprowadzenia zabiegu chirurgicznego i późniejszego przeniesienia na stolik mikroskopu intravitalnego. Podstawa z Sylgardu zaznaczona jest czerwoną strzałką. Wokół całego preparatu znajduje się koralik wodoodpornego silikonu, aby zatrzymać wszelkie roztwory, które mogą wyciec podczas procedury intravitalnej, zapobiegając ich skapywaniu na mikroskop.
<img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig2.jpg" alt="Konfiguracja mikroskopu do badań optycznych; obrazy A-C przedstawiają soczewki, regulatory ostrości oraz mechanizm stolika." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2. Dostosowany mikroskop MacroZoom do obrazowania szerokopolowego. A) Korpus mikroskopu MVX10 (Olympus) z kamerą ICCD XR/Mega-10 (Stanford Photonics) zamontowaną w porcie trynocularnym. B) Widok z bliska korpusu mikroskopu. (a) regulacja zoomu (0,63 do 6,3X); (b) koło filtrów; (c) podwajacz obrazu (NA = 0,50 przy 25-krotnym powiększeniu optycznym). C) Kondensator podpomiałowy do oświetlenia w polu jasnym (Köhlera) (NA kondensatora = 0,5, odległość robocza = 27 mm). 
<img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig3.jpg" alt="Aparat do badań na zwierzętach z gryzoniem w komorze eksperymentalnej; biofeedback, analiza inwazyjna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Gotowa preparacja mięśnia kremaster myszy. Zznieczulona mysz w pozycji grzbietowej na ciepłej, pokrytej tworzywem aluminiowej platformie (żółta). Pozycja ciała została zabezpieczona taśmą. Mięsień kremaster jest rozłożony promieniście na przezroczystym postumencie z gumy silastykowej i przytwierdzony szpilkami na brzegach. Roztwór perfuzyjny jest podawany na końcu proksymalnym za pomocą plastikowego dozownika (biała strzałka). Linia próżniowa (biały grot strzałki) odprowadza roztwór poprzez knot z chusteczki Kimwipe. Przedstawiono dwie mikropipety z końcówkami umieszczonymi w tkance. Elektroda referencyjna (srebrny drut) jest przymocowana do dolnej krawędzi mięśnia kremaster.
<img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig4.jpg" alt="Obrazy mikroskopowe struktur włókien; schemat zróżnicowanych obserwacji morfologicznych; analiza materiałowa." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4. Ilustracja zakresu powiększenia dla wizualizacji sieci tęczniczych wykazujących ekspresję GCaMP2 w śródbłonku. A) obraz fluorescencyjny i B) obraz w polu jasnym wykonany przy powiększeniu optycznym 3,2X, co daje całkowite powiększenie = 42X na monitorze wideo. [Pole widzenia (FOV) = 4 375 x 3,470 μm]. Pasek skali = 500 μmPraca przy takim powiększeniu ułatwia umieszczenie mikropipet w wybranych miejscach. C) Obraz fluorescencyjny i D) obraz w świetle przechodzącym wykonane przy powiększeniu optycznym 6,4X dla całkowitego powiększenia = 83X (pole widzenia = 2 20 x 1,759 μm). Pasek skali = 200 μm. E) obraz fluorescencyjny i F) obraz w polu jasnym wykonane przy powiększeniu optycznym 12,6X dla powiększenia całkowitego = 165X (FOV = 1 10 x 885 μm). Pasek skali = 100 μmG) Z podwajaczem obrazu, powiększenie optyczne = 25,2X. Odcinek skali = 50 μm.

<ol><li>Majno, G., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+inflammation.+1.+The+effect+of+histamine+and+serotonin+on+vascular+permeability%3A+an+electron+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys.+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).</li>
<li>Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+inflammation.+II.+The+site+of+action+of+histamine+and+serotonin+along+the+vascular+tree%3A+a+topographic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys.+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).</li>
<li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Observation+of+Skeletal+Muscle+Blood+Vessels+%28Rat+Cremaster%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster).</a> J. Physiol. 172, 123-137 (1964).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Bohlen, H. G., Gore, R. W., Hutchins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microvascular+pressures+in+normal+and+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of microvascular pressures in normal and spontaneously hypertensive rats.</a> Microvasc. Res. 13, 125-130 (1977).</li>
<li>Klitzman, B., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+hematocrit+and+red+cell+flow+in+resting+and+contracting+striated+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Microvascular hematocrit and red cell flow in resting and contracting striated muscle.</a> Am. J. Physiol. 237, 481-490 (1979).</li>
<li>Hungerford, J. E., Sessa, W. C., &amp, S. egal, S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasomotor+control+in+arterioles+of+the+mouse+cremaster+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle.</a> FASEB J. 14, 197-207 (2000).</li>
<li>Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+of+connexin40+in+the+propagation+of+electrically+activated+vasodilation+in+mouse+cremasteric+arterioles+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo.</a> Circ. Res. 92, 793-800 (2003).</li>
<li>Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin45+cannot+replace+the+function+of+connexin40+in+conducting+endothelium-dependent+dilations+along+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles.</a> Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).</li>
<li>Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+importance+of+the+endothelial+K%2B+channel+SK3+and+connexin40+in+arteriolar+dilations+during+skeletal+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction.</a> FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).</li>
<li>Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+impaired+neurovascular+transmission+in+a+murine+model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).</li>
<li>Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagated+endothelial+Ca2%2B+waves+and+arteriolar+dilation+in+vivo%3A+measurements+in+Cx40BAC-GCaMP2+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice.</a> Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).</li>
<li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+denervation+on+skeletal+muscle+blood+vessels+%28rat+cremaster%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> J. Anat. 100, 305-316 (1966).</li>
<li>Proctor, K. G., Busija, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+among+arteriolar%2C+regional%2C+and+whole+organ+blood+flow+in+cremaster+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle.</a> Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).</li>
<li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation%3A+Role+of+conducted+vasodilation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiol. , (2011).</li>
<li>Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cremaster+muscle+hemodynamics+due+to+disruption+of+the+deferential+feed+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels.</a> Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).</li>
</ol>

Wszystkie procedury i protokoły z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Missouri i przeprowadzone zgodnie z Guide for the Care and Use of Laboratory Animals National Institutes of Health. 
Produkcja niniejszego artykułu wideo została sfinansowana przez Stanford Photonics.

Opisujemy tutaj preparat otwartego mięśnia kremastra u myszy do obserwacji mikrokrążenia. in vivoProcedura ta została opracowana na podstawie metody „otwartego” przygotowania mięśnia kremaster, po raz pierwszy opisanej u szczura4Dzięki praktyce cała procedura chirurgiczna może zostać przeprowadzona w czasie krótszym niż 1 godzina. Wszechstronność tej preparacji umożliwia zastosowanie wielu manipulacji eksperymentalnych; metoda ta jest łatwo adaptowalna zarówno do chomików, jak i szczurów, co pozwala na badanie różnorodnych modeli eksperymentalnych w podobny sposób. Preparacja jest ograniczona do samców; pomiary należy wykonywać w kierunku centrum tkanki, unikając obszarów uszkodzonych w pobliżu krawędzi mięśnia.14Należy również uznać, że rozkłady ciśnienia i przepływu ulegają zmianie w przypadku przecięcia naczyń łączących mięśnia opuszkowo-żylnego16mikronaczynia pozostają reaktywne i odpowiednie do powtarzalnego gromadzenia danych. Głównym ograniczeniem w obrazowaniu mikrokrążenia w mięśniu kremaster jest narastanie tkanki łącznej w miarę dojrzewania i wzrostu zwierząt, szczególnie u szczurów, ale także u chomików. Ponadto, wraz z przybieraniem na wadze przez zwierzęta, trudniej staje się kontrolować znieczulenie, ponieważ pentobarbital jest lipofilny i może być absorbowany przez tkankę tłuszczową. Najlepszym sposobem postępowania jest zachowanie cierpliwości przy jednoczesnym zapewnieniu, aby zwierzę&deg;temperatura ciała jest utrzymywana na poziomie ~37°C &deg;C podczas ciągłego przemywania odsłoniętej tkanki roztworem PSS.

<table><tbody><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S642-212</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Nembutalu sodowego</td><td>Lundbeck Inc</td><td>NDC 67386-501-55</td><td>Znany również jako pentobarbital sodu</td></tr><tr><td>Kontroler temperatury</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td>Alternatywa: regulowany zasilacz 12V DC</td></tr><tr><td>Zestaw grzewczy platformy Series 20 RH-2</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0274</td><td>Wymaga niestandardowej płyty aluminiowej</td></tr><tr><td>Kamera Mega-10</td><td>Stanford Photonics Inc</td><td>XR/Mega-10</td><td></td></tr><tr><td>MVX10</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw MV PLAPO 2XC</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Statyw hybrydowy MVX10</td><td>Leeds</td><td>LBX-Hybrid</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie sterujące Piper</td><td>Stanford Photonics Inc</td><td></td><td>Program do kamery Mega-10</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Wodoodporny silikonowy uszczelniacz (przezroczysty)</td><td>GE Healthcare</td><td>47970-72643-LW5000</td><td>Inne przezroczyste uszczelniacze silikonowe również będą odpowiednie</td></tr><tr><td>Szalka Petriego 60 x 15mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13A</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do mikrosekcji</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>#5/45</td><td></td></tr><tr><td>Membrana GP Millipore Express PLUS</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>Szpile entomologiczne Minutiens</td><td>Austerlitz</td><td>Rozmiar M 0.15 mm</td><td></td></tr><tr><td>Kompaktowy trymer do zwierząt</td><td>Wahl Clipper Corp.</td><td>Model 9966</td><td>Czyścić po każdym użyciu</td></tr></tbody></table>

przygotowanie mięśnia kremastra myszy do obrazowania intravitalnego mikrokrążenia

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

W całym organizmie utrzymanie homeostazy wymaga stałej dostawy tlenu i składników odżywczych, przy jednoczesnym usuwaniu produktów przemiany materii. Równowaga ta jest osiągana dzięki przepływowi krwi w mikrokrążeniu, które obejmuje najmniejsze odgałęzienia sieci naczyniowej we wszystkich tkankach i narządach. Tętniczki odchodzą od tętnic, tworząc sieci kontrolujące rozkład i ilość utlenowanej krwi napływającej do licznych naczyń włosowatych, ściśle powiązanych z komórkami miąższu. Kapilary zapewniają dużą powierzchnię wymiany dyfuzyjnej między komórkami tkanki a krwią. Żyłki zbierają odpływ z naczyń włosowatych i zbiegają się, transportując odtlenowaną krew z powrotem w kierunku serca. Obserwacja tych procesów w czasie rzeczywistym wymaga zastosowania podejścia eksperymentalnego umożliwiającego wizualizację i manipulację żywym mikrokrążeniem.
Mięsień żyrakowy szczurów był pierwotnie wykorzystywany jako model do badania stanu zapalnego z użyciem histologii i mikroskopii elektronowej po śmierci1,2. Pierwszy raport in vivo dotyczący odsłoniętego, nienaruszonego mięśnia żyrakowego szczura badał odpowiedzi mikro naczyniowe na leki naczyniokurczące i naczyniorozkurczające przy użyciu światła odbitego3. Jednakże krzywizna mięśnia oraz brak skupionego oświetlenia ograniczały użyteczność tego preparatu. Przełom polegał na rozcięciu mięśnia, oddzieleniu go od jądra i rozłożeniu promieniście w formie płaskiego płata do transiluminacji pod mikroskopem złożonym4. Choć wykazano, że jest to cenny preparat do badania fizjologii mikrokrążenia u szczurów5 i chomików6, mięsień żyrakowy myszy7 okazał się szczególnie użyteczny w analizie szlaków komórkowych zaangażowanych w regulację funkcji mikronaczyniowej8-11 oraz w obrazowaniu w czasie rzeczywistym sygnalizacji międzykomórkowej12.
Mięsień dźwigacz jądra powstaje z mięśnia skośnego wewnętrznego oraz mięśnia poprzecznego brzucha w czasie zstępowania jąder przez kanał pachwinowy13. 
Służy on do podtrzymywania (gr. cremaster = podwieszka) i utrzymywania temperatury jąder. Jak opisano w niniejszej pracy, mięsień dźwigacz jądra jest przygotowywany w formie cienkiego, płaskiego płata, co zapewnia doskonałą rozdzielczość optyczną. Przy zachowaniu stabilnej temperatury ciała i poziomu znieczulenia myszy, przygotowanie chirurgiczne polega na uwolnieniu mięśnia z otaczających go tkanek oraz od jąder, rozprostowaniu go na przezroczystym podeście z gumy silastykowej i zabezpieczeniu krawędzi szpilkami entomologicznymi przy jednoczesnym ciągłym nawadnianiu roztworem soli fizjologicznej. Niniejszy protokół wykorzystuje myszy transgeniczne wykazujące ekspresję GCaMP2 w komórkach śródbłonka tętniczek. GCaMP2 jest genetycznie zakodowaną fluorescencyjną cząsteczką wskaźnika wapnia12. Obrazowanie szerokopolowe oraz kamera CCD z wzmacniaczem obrazu umożliwiają badanie sygnalizacji wapniowej w śródbłonku tętniczek in vivo.

Opisano przygotowanie tkanki do wizualizacji i manipulacji eksperymentalnej żywego mikrokrążenia. U znieczulonych samców myszy przygotowano cienki, silnie unaczyniony mięsień kremaster do mikroskopii przyżyciowej w celu badania sieci mikronaczyniowych, w tym tętniczek, kapilar i żyłek. Metoda ta może być łatwo dostosowana do szczurów i chomików.

Przygotowanie mięśnia kremastra myszy do obrazowania intravitalnego mikrokrążenia

W całym organizmie utrzymanie homeostazy wymaga stałej dostawy tlenu i składników odżywczych przy jednoczesnym usuwaniu produktów przemiany materii...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie mięśnia opuszkowo-żylnego w celu badania żywego mikrokrążenia u znieczulonego samca myszy. Zabieg chirurgiczny rozpoczyna się od nacięcia brzusznej powierzchni moszny. Po zgoleniu obszaru następnym krokiem jest oczyszczenie i oddzielenie mięśnia opuszkowo-żylnego od otaczających go tkanek.Następnie wykonuje się orchiektomię, a tkankę rozkłada się promieniście na powierzchni przezroczystego postumentu. Tak przygotowany preparat można poddać badaniu mikroskopowemu w celu obrazowania mikrokrążenia w obrębie mięśnia opuszki. W rezultacie można uzyskać dane ukazujące, w jaki sposób przepływ krwi i dostarczanie tlenu są faktycznie kontrolowane w żywych systemach w stanach zdrowia i w modelach chorobowych, a także w odpowiedzi na manipulacje eksperymentalne.Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na podstawowe pytania w badaniach medycznych nad układem sercowo-naczyniowym, ze szczególnym uwzględnieniem mikrokrążenia. W szczególności pozwala ona zbadać, w jaki sposób przepływ krwi i dostarczanie tlenu mogą być regulowane na poziomie komórkowym w nienaruszonym systemie. Metoda ta umożliwia zatem uzyskanie wglądu w funkcje mikrokrążenia myszy in vivo.Metodę tę można zastosować również w innych modelach gryzoni, takich jak chomiki i szczury. Aby ustabilizować mysz pod mikroskopem, konieczne będzie przygotowanie dodatkowego sprzętu. Rozpocznij od wykonania przezroczystej, prostokątnej płyty z pleksiglasu, dopasowanej do stolika mikroskopu.Następnie przygotuj przezroczystą podstawkę z Sylgard 180 w proporcji 4:1, wlewając go do szalki Petriego. Aby uzyskać grubość 15 mm, poddaj wylany Sylgard działaniu próżni w komorze próżniowej przez jedną godzinę. W celu usunięcia pęcherzyków powietrza i poprawy przejrzystości, utwardzaj odgazowany Sylgard w piecu w temperaturze 50 °C przez około cztery godziny.Po utwardzeniu wyciąć podstawkę w kształcie pięciokąta z zaokrągloną górną krawędzią. Następnie przymocować blok podstawki do prostokątnej płyty z pleksiglasu, nakładając cienką warstwę przezroczystego wodoodpornego silikonu, i pozostawić do utwardzenia na noc. Następnie zbudować platformę w kształcie klina, aby odpowiednio ustawić mysz względem podstawki.Platformę klinową można wykonać z tworzywa akrylowego, a do utrzymania ciepłoty preparatu można użyć lampy grzewczej. Alternatywnie do plastikowego klina można zamontować aluminium. Aluminium jest ogrzewane za pomocą elementów grzejnych o określonej rezystancji podłączonych do zasilacza prądu stałego.Na koniec, w dniu eksperymentu, przygotuj PSS buforowany węglanem w wodzie ultraczystej. Mieszanie soli w dniu eksperymentu pozwala uniknąć wytrącania się wodorowęglanów. Przechowuj PSS w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C i przy użyciu dyspergera gazowego nasyć PSS mieszaniną 5% dwutlenku węgla w azocie przez 15 minut.Dostosowuje to pH do około 7.4 i dodatkowo zapobiega wytrącaniu się soli. Po znieczuleniu dorosłej myszy ostrożnie ogol sierść z dolnej części brzucha, dolnej części pleców, moszny i nóg. Należy zachować szczególną ostrożność w okolicy moszny i jąder, aby nie uszkodzić znajdującego się pod nimi mięśnia kremaster.Usuń luźną sierść za pomocą świeżego gazika z alkoholem. Sprawdź, czy pęcherz moczowy jest pełny. Jeśli jest pełny, będzie wyczuwalny przez ścianę brzuszną jak małe winogrono; w takim przypadku go opróżnij.Stosując delikatny nacisk i trzymając końcówkę chusteczki Kimwipe obok prącia, należy zebrać mocz. Następnie ułożyć mysz na grzbiecie na platformie z klinem tak, aby tylne kończyny opierały się po obu stronach cokołu zabezpieczającego, a następnie unieruchomić mysz, dociskając krocze do cokołu. Aby utrzymać tę pozycję, należy luźno przykleić kawałek taśmy w poprzek klatki piersiowej i przymocować ją do platformy.Operację rozpocznień od przymocowania pinu przez wierzchołek worka moszny do podstawy, aby napiąć skórę moszny. Następnie należy rozpocząć i utrzymywać superfuzję PSS nad polem operacyjnym przez cały czas trwania sekcji. Aby usuwać odpływ PSS, należy umieścić chusteczkę Kimwipe tak, aby jeden jej koniec znajdował się obok worka moszny, a drugi przy linii próżniowej.Używając nożyczek do mikrodysekcji i trzymając skórę za pomocą pęsety kątowej, wykonaj pionowe nacięcie wzdłuż brzusznej powierzchni moszny, jeżeli jądro zostało wciągnięte do jamy brzusznej przez mięsień opuszkowy. Delikatny ucisk w dolnej części brzucha skieruje jądro do moszny. Następnie zidentyfikuj powierzchnię mięśnia opuszkowego pokrywającego jądro i ostrożnie usuń tkankę łączną znajdującą się pomiędzy nim a skórą moszny.Aby odsłonić mięsień żylny jądra, delikatnie odsuń skórę moszny za proksymalną krawędź podstawy i zabezpiecz ją po obu stronach. Następnie, za pomocą szpilki, oczyść zewnętrzną powierzchnię mięśnia z tkanki łącznej. Wbij szpilkę w wierzchołek mięśnia żylnego jądra, aby go napiąć, a następnie bardzo ostrożnie wykonaj nacięcie podłużne przez jego powierzchnię brzuszną, starając się zminimalizować uszkodzenie naczyń krwionośnych.Mięsień kremaster jest połączony cienkim więzadłem z EPIs. Pod jądrem odsunąć jądro na jedną stronę. Pozwala to odsłonić to więzadło, które zostaje ostrożnie oddzielone od EPIs.W pobliżu szczytu mięśnia opuszkowego znajduje się niewielka para tętnicy i żyły połączonych z najądrzem. Zaciśnij te naczynia pęsetą i rozciągnij je, aby zminimalizować krwawienie. Następnie wykonaj orchiektomię, obejmując proksymalnie poduszeczkę tłuszczową pachwinową, i podwiąż jądro, najjaźdrze oraz tętnicę i żyłę jądrową.Następnie należy je przeciąć i usunąć. Oczyścić mięsień cremation z pozostałej tkanki łącznej, a następnie rozłożyć go promieniście na powierzchni podstawy. Krawędzie należy przymocować od pięciu do sześciu szpilkami, aby uzyskać płaski płat mięśnia prążkowanego z nienaruszoną mikrocyrkulacją.Przenieś przygotowany preparat na stoлик mikroskopu intravitalnego, stale podgrzewanego do 34 °C, i pozostaw do equilibracji na 30 minut. Przed manipulacją eksperymentalną lub zbieraniem danych, przy użyciu zmodyfikowanego mikroskopu z oświetleniem w polu jasnym i oświetleniem epi, wykonano cyfrowe zdjęcia preparatu mięśnia kremastra przy użyciu oświetlenia w polu jasnym. Mięsień wizualizowano przy powiększeniach 42x, 83x i 165x w trybie fluorescencji. Po jego rozwinięciu mięsień wizualizowano przy powiększeniach 42x, 83x, 165x i 330x.Technika ta utorowała drogę badaczom mikrokrążenia do analizy mechanizmów leżących u podstaw regulacji tkanek, przepływu krwi, dostarczania tlenu oraz stanu zapalnego. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby delikatnie obchodzić się z tkanką, aby upewnić się, że reaktywność mikronaczyniowa pozostała nienaruszona.

the-mouse-cremaster-muscle-preparation-for-intravital-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Preparat mięśnia unerwiającego wyciągacza szczura do obrazowania in vivo mikrokrążenia

Przedstawiono nową, wszechstronną metodę obserwacji mikrokrążenia. Jest ona uważana za odpowiednią do długotrwałej obserwacji oraz do łączenia z interwencjami farmakofizjologicznymi lub biologii molekularnej.

Pomiar mikrokrążenia in vivo w mięśniach szkieletowych za pomocą mikroskopii intravitalnej

Mikroskopia wewnątrzżyciowa do śledzenia czasowych i przestrzennych zdarzeń hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu opony miękkiej.

Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okna czaszkowego

Mikrojontoforeza polega na przemieszczaniu jonów z mikropipety w odpowiedzi na różnicę potencjałów elektrycznych między wnętrzem a zewnętrzem mikropipety. Dzięki temu cząsteczki biologicznie czynne są dostarczane proporcjonalnie do natężenia prądu elektrycznego. Przedstawiamy mikrojontoforezę acetylocholiny w połączeniu z mikromanipulacją w celu zbadania rozszerzenia naczyń zależnego od śródbłonka w mikrokrążeniu.

Mikrojontoforeza i mikromanipulacja w obrazowaniu fluorescencyjnym mikrokrążenia in vivo

Opisujemy protokół mikroskopii intravitalnej w świetle jasnym do pomiaru dynamicznych oddziaływań między neutrofilami a komórkami śródbłonka podczas rekrutacji neutrofili w odpowiedzi na źródło chemoatraktanta dla neutrofili in vivo. Pełzanie neutrofili wewnątrz naczyniowych, migracja transendotelialna oraz chemotaksja w tkance mięśnia kroczo ścięgnistego myszy są wizualizowane za pomocą fotografii wideo z odstępami czasu i śledzone przy użyciu programu ImageJ.

Śledzenie pełzania wewnątrznaczyniowego, migracji transendotelialnej i chemotaksji neutrofili w tkankach za pomocą intravitalnej wideomikroskopii

Cyfrowa intravitalna mikroskopia epifluorescencyjna żyłek posutniczych w mikrokrążeniu mięśnia dźwigacza jest wygodną metodą pozwalającą na uzyskanie wglądu w interakcje leukocytowo-śródbłonkowe in vivo w przypadku uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego (IRI) prążkowanej tkanki mięśniowej. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół bezpiecznego wykonania tej techniki oraz omawiamy jej zastosowania i ograniczenia.

Obrazowanie cyfrowe w czasie rzeczywistym oddziaływania leukocytów z nabłonkiem śródbłonkowym w urazie niedokrwienno-reperfuzji (IRI) mięśnia kremaster szczura

Tutaj przedstawiamy eksperymentalną technikę fluorescencji pod mikroskopem przyżyciowym do wizualizacji heterotypowych interakcji płytkowo-neutrofilowych na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy. Ta mikroskopowa technologia będzie cenna w badaniu molekularnego mechanizmu chorób naczyniowych i testowaniu środków farmakologicznych w warunkach patofizjologicznych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy

Mikroskopia przyżyciowa myszy M. cremaster microcirculation oferuje unikalny i dobrze ustandaryzowany model in vivo do analizy migracji komórek macierzystych szpiku kostnego obwodowego.

Mikroskopia przyżyteczna mikrokrążenia w mięśniu Cremaster myszy do analizy migracji obwodowych komórek macierzystych

Mikroskopia przyżyciowe to potężne narzędzie, które umożliwia obrazowanie różnych procesów biologicznych u żywych zwierząt. W tym artykule przedstawiamy szczegółową metodę obrazowania dynamiki struktur subkomórkowych, takich jak ziarnistości wydzielnicze, w gruczołach ślinowych żywych myszy.

Mikroskopia przyżyteczna do obrazowania struktur subkomórkowych u żywych myszy wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych

Szczegółowo opisujemy protokół monitorowania zachowania neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej przyżyciowej na znieczulonych myszach.

Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym

To badanie demonstruje chirurgiczne przygotowanie mięśnia cremaster szczura do wizualizacji warstwy wolnej od komórek in vivo. W pracy omówiono istotne czynniki wpływające na dokładność pomiaru szerokości warstwy bezkomórkowej.

Wizualizacja i kwantyfikacja warstwy bezkomórkowej w tętniczkach mięśnia Cremaster szczura

Tutaj pokazujemy, jak wykonać mikroskopię przyżyciową na żyłkach powłosilarnych mięśnia cremaster myszy. Powszechnie stosowany do różnych modeli zapalenia i sepsy, szczególnie tych indukowanych przez chemokiny i cytokiny, podkreślamy jego znaczenie w badaniu muskolopatii obejmujących przesadny naciek leukocytów mięśniowych.

Naciek leukocytów mięśnia Cremaster u myszy oceniany za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Poznaj metodę przygotowania mięśnia kremasterowego myszy do przyżyciowego obrazowania mikrokrążenia. Technika ta umożliwia badanie regulacji przepływu krwi i dostarczania tlenu na poziomie komórkowym w układzie naczyniowym.

Przygotowanie mięśnia kremastra myszy do obrazowania intravitalnego mikrokrążenia

Przeglądaj więcej filmów