Disekcja i obrazowanie pojedynczego ommatidium Drosophila
19 sierpnia 2011
Czynnikiem ograniczającym wykorzystanie oka dorosłych Drosophila w badaniach nad neurodegeneracją i biologią komórki jest trudność w obrazowaniu procesów wewnątrzkomórkowych. Opisujemy metodę preparowania pojedynczych ommatidiów w celu utworzenia właściwej pierwotnej hodowli komórek neuronalnych, która może być poddawana działaniu leków oraz zaawansowanemu obrazowaniu.
Ogólnym celem tej procedury jest sekcja i obrazowanie pojedynczych osobników drosophila lub matia w celu badania zjawisk wewnątrzkomórkowych w modelach neurodegeneracji. Osiąga się to poprzez oddzielenie głowy muchy od reszty ciała, a następnie rozcięcie jej.
Następnie z wnętrza głowy usuwa się mózg i pozostałe tkanki. Potem usuwa się kutykulę, a każdą siatkówkę przecina się na pół. Ostatnim krokiem procedury jest wycięcie warstwy O za pomocą igły wolframowej i umieszczenie jej na szkiełku przedmiotowym.
W efekcie można uzyskać wyniki obrazujące cytoplazmatyczne organelle autofagiczne za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Główną zaletą tej techniki jest umożliwienie wysokorozdzielczej analizy biologii komórki w modelach neurodegeneracji u muszek owocówek (drosophila), które do tej pory oferowały w tej dziedzinie jedynie wgląd genetyczny, co dowodzi, że procedura ta może być różnorodna. Procedurę przeprowadził student studiów podyplomowych z mojego laboratorium przy pomocy Daniela Mackaya, technika histologii i mikroskopii w ośrodku.
Aby rozpocząć, należy napełnić jedną studzienkę szklanego preparatu trzechstudzienkowego solą fosforanową (PBS), a następnie znieczulić muchy dwutlenkiem węgla. Po znieczuleniu much, za pomocą pęsety należy chwycić pojedynczą muchę i umieścić ją w niewielkiej ilości PBS. Pod mikroskopem stereoskopowym należy ująć pęsetą aparat gębowy, a następnie oddzielić głowę od ciała poprzez przecięcie szyi.
Używając drugiej pary pęsety do przytrzymania głowy muchy za aparat gębowy, przetnij głowę na pół wzdłuż bocznej linii środkowej dzioba za pomocą mikronozyciówek. Aby odsłonić mózg, użyj uciętego końcówki pipety, by podnieść głowę, chwytając za siatkówkę, a następnie przenieś ją do innej studni wypełnionej podłożem Schneidera. Usuń pęsetą większość kutykuli głowy, a następnie wyjmij mózg.
Utrzymaj siatkówkę w pozycji zaklinowanej między lamellą a rogówką. Następnie przenieś siatkówkę do 50 µl kropli świeżego medium Schneidera. Po umieszczeniu bezpośrednio na szkiełku przedmiotowym, chwyć pęsetą najbardziej grzbietowy lub brzuszny koniec siatkówki, używając mikronożyczek.
Przetnij siatkówkę na pół wzdłuż linii środkowej grzbietowo-brzusznej, aby odsłonić AMIA w środkowej części oka. Kontynuuj trzymanie siatkówki w taki sposób, aby rogówka była skierowana w dół, a blaszka (lamina) w górę. Używając cienkiej igły wolframowej, odseparuj najpierw oia od blaszki, a następnie od rogówki.
Pojedyncze OIA i grupy OIA będą osadzać się na dnie dołka lub szkiełka. Przed kontynuacją usuń wszelkie większe pęcherzyki powietrza, które mogły się zebrać. Aby przeanalizować autofagię, rozcieńcz LysoTracker w stosunku 1:1000 w kropli pożywki Schneidera, wymieszaj i odczekaj 10 sekund.
Usuń nadmiar płynu z preparatu, uważając, aby nie usunąć AMIA. Dodaj kroplę medium Vector Shield, aby przykryć AMIA.
Nałóż szkiełko nakrywkowe i zabezpiecz krawędzie lakierem do paznokci. Wykorzystując mikroskopię konfokalną, można zwizualizować zarówno autofagosomy znakowane g fp a TG eight, jak i lizosomy znakowane lyo Tracker w pojedynczym tedium wypreparowanym z muchy wykazującej mutantową formę atropin. Panel w świetle przechodzącym w prawym górnym rogu przedstawia niemal nienaruszoną strukturę tedium, a ramka wskazuje obszar skanowania. Tutaj kolor czerwony oznacza lizosomy, a zielony autofagosomy.
Autolizosomy, powstałe w wyniku fuzji dwóch organelli, wykazują żółte zabarwienie. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak hodowla materiału oraz podawanie leków, aby odpowiedzieć na różne pytania badawcze, na przykład dotyczące związków skutecznie wpływających na markery autofagii w komórkach neuronalnych o różnym tle genetycznym.
Połączenie zalet genetyki Drosophila z zaawansowanymi analizami biologii komórki, możliwymi do przeprowadzenia w hodowlach komórkowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje procedurę wyobcowania i obrazowania pojedynczych ommatidiów Drosophila w celu badania zdarzeń wewnątrzkomórkowych w modelach neurodegeneracji. Metoda ta umożliwia generowanie pierwotnych kultur komórek neuronalnych, które mogą być poddawane działaniu leków oraz zaawansowanym technikom obrazowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Neurodegeneracja
Wprowadzenie
- Obrazowanie procesów wewnątrzkomórkowych u dorosłych much Drosophila jest trudne.
- Disekcja pojedynczych ommatidiów stanowi rozwiązanie pozwalające na badanie mechanizmów komórkowych.
- Pierwotne kultury neuronalne umożliwiają podawanie leków i zaawansowane obrazowanie.
- Podejście to pogłębia zrozumienie procesów neurodegeneracyjnych.
Cel badania
- W celu przeprowadzenia sekcji ommatidiów Drosophila do analizy komórkowej.
- Aby ułatwić obrazowanie procesów wewnątrzkomórkowych.
- W celu stworzenia platformy do badań nad działaniem leków.
Zastosowane metody
- Przymocuj głowę muchy i rozetnij ją.
- Usuń mózg oraz pozostałe tkanki wewnętrzne.
- Po usunięciu kutykuli przetnij siatkówkę na pół.
- Wydziel ommatidia za pomocą igły wolframowej i umieść je na szkiełku podstawowym.
Główne wyniki
- Pomyślna dyssekcja pojedynczych ommatidiów.
- Utworzenie autentycznych pierwotnych kultur komórek neuronalnych.
- Możliwość przeprowadzania zabiegów farmakologicznych na hodowlach komórkowych.
- Zaawansowane techniki obrazowania zastosowane do badania procesów wewnątrzkomórkowych.
Wnioski
- Metoda ta stanowi cenne narzędzie do badania neurodegeneracji.
- Disekcja pojedynczych ommatidiów zwiększa możliwości obrazowania komórkowego.
- Podejście to może prowadzić do nowych odkryć w dziedzinie neurobiologii.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Disekcjonowanie i obrazowanie pojedynczego ommatidium u Drosophila umożliwia wysokorozdzielczą analizę zdarzeń wewnątrzkomórkowych związanych z neurodegeneracją, pokonując ograniczenia wynikające z autofluorescencji całego oka. Technika ta wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka oraz walidację celów we wczesnych fazach odkrywania leków, pozwalając na bezpośrednią wizualizację procesów autofagii i odpowiedzi na leki w genetycznie zdefiniowanych komórkach neuronalnych. Jej możliwość adaptacji do obrazowania na żywo oraz podawania związków czyni ją reużywalną platformą dla procesów badawczych nad neurodegeneracją.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę autofagii i transportu wewnątrzkomórkowego w neuronach istotnych dla przebiegu chorób.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez wizualizację odpowiedzi subkomórkowych na perturbacje genetyczne lub farmakologiczne.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnienie efektów autonomicznych komórkowych w mozaikowych tłach genetycznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany system ex vivo do ilościowego obrazowania markerów autofagii i lizosomów.
- Umożliwia powtarzalne przygotowanie próbek pojedynczych komórek do standaryzowanych testów związków.
- Wspiera skalowalność testów i ponowne wykorzystanie platformy do przesiewania agentów modyfikujących procesy neurodegeneracyjne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne ze ścieżkami istotnymi dla przebiegu choroby poprzez modelowanie dysfunkcji autofagii w systemie podatnym na manipulacje genetyczne.
- Zapewnia ciągłość od odkryć genetycznych po przedkliniczną ocenę związków w komórkach neuronalnych.
- Wspiera optymalizację ryzyka w procesie rozwoju poprzez dostarczanie predykcyjnych odczytów komórkowych dla celów neurodegeneracyjnych.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta stanowi pomost między wczesną fazą odkrywania a badaniami przedklinicznymi, umożliwiając weryfikację hipotez dotyczących mechanizmów wewnątrzkomórkowych i efektów działania związków w genetycznie zdefiniowanym kontekście neuronalnym.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących szlaków autofagii i neurodegeneracji w pojedynczych ommatidiach.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, powtarzalnych wyników obrazowania do oceny związków chemicznych.
- Analityka: Umożliwia pomiary autofagosomów, lizosomów i ich produktów fuzji z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie fenotypów komórkowych do modeli chorób oraz opracowywanie biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje modułową platformę możliwą do adaptacji do różnych tło genetycznych i bibliotek związków.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz w badaniach mechanistycznych nad neurodegeneracją.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy w zakresie dyssekcji pojedynczych komórek i obrazowania w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie bezpośrednich dowodów komórkowych na zaangażowanie celu i skuteczność związku.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów neurodegeneracyjnych i kandydatów terapeutycznych z uwzględnieniem poziomu ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w preparatyce Drosophila oraz technikach obrazowania konfokalnego.
- Wymaga dostępu do mikroskopii fluorescencyjnej i infrastruktury do hodowli komórkowych.
- Wymaga standaryzacji protokołów przygotowania próbek i obrazowania pomiędzy zespołami.
- Można dostosować do różnych tło genetycznych z wykorzystaniem technik analizy mozaikowej.
- Ograniczone do analizy ex vivo; dla zachowania ciągłości translacyjnej może być wymagana walidacja in vivo.
