Name: Pojedyncze rozwarstwienie i obrazowanie Drosophila ommatidium (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: Poznaj metodę rozwarstwiania i obrazowania pojedynczych ommatidiów Drosophila w celu badania zdarzeń wewnątrzkomórkowych w modelach neurodegeneracyjnych. Technika umożliwia tworzenie pierwotnych kultur neuronowych do analizy farmakologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Bernardowi Charrouxowi za dyskusje. Praca ta była finansowana przez KCL Biomedical School.

1. Disekcja siatkówki Drosophila
<ol>
<li>Napełnić jeden otwór szkiełka przedmiotowego z 3 otworami fosforanem soli buforowych (PBS 1X), a następnie znieczulić muchy za pomocą CO2. W tym eksperymencie można wykorzystać zarówno samce, jak i samice.</li>
<li>Po znieczuleniu much, chwycić pojedynczą muchę pęsetą i umieścić ją w małym naczyniu z PBS.</li> 
<li>Pod mikroskopem stereoskopowym chwycić pęsetą trąbkę, a następnie oddzielić głowę od ciała, przecinając szyję drugą pęsetą.</li>
<li>Trzymając głowę muchy za trąbkę, przeciąć ją na pół wzdłuż linii środkowej lewo-prawo za pomocą mikronozyciór, aby odsłonić mózg.</li>
<li>Używając ściętej końcówki pipety, pobrać siatkówkę i przenieść ją do drugiego otworu szkiełka przedmiotowego z 3 otworami, wypełnionego pożywką Schneidera.</li>
<li>W pierwszej kolejności usunąć pęsetą większość kutykuli głowy, a następnie wyciągnąć mózg. Należy zachować siatkówkę uciśniętą między laminą a rogówką.</li>
<li>Następnie przenieść siatkówkę do kropli (50 μl) świeżej pożywki Schneidera umieszczonej bezpośrednio na szkiełku przedmiotowym.</li>
</ol>
2. Disekcja ommatidiów
<ol>
<li>W zależności od końcowego celu preparacji (natychmiastowe obrazowanie lub hodowla) oraz rodzaju optyki mikroskopu fluorescencyjnego (prosty lub odwrócony), ten etap można przeprowadzić na szkiełku przedmiotowym lub w płytce 24-dołkowej. W celu realizacji zadania opisanego w tej procedurze, ommatidia zostaną wypreparowane bezpośrednio na szkiełku szklanym.</li>
<li>Chwyć pęsetą najbardziej grzbietowy lub brzuszny koniec siatkówki. Za pomocą mikronożyczek przetnij siatkówkę na pół wzdłuż linii środkowej grzbietowo-brzusznej, aby odsłonić ommatidia w środkowej części oka.</li>
<li>Nadal trzymaj siatkówkę tak, aby rogówka była skierowana w dół, a lamina w górę. Używając cienkiej igły wolframowej, oddziel ommatidia od laminy i rogówki.</li>
<li>Pojedyncze ommatidia oraz ich grupy zbiorą się na dnie dołka lub szkiełka. Przed kontynuacją usuń wszelkie większe zanieczyszczenia, które mogły się tam zebrać.</li>
</ol>
3. Traktowanie, barwienie i obrazowanie
<ol>
<li>Aby przeanalizować autofagię, rozcieńczyć Lysotracker w stosunku 1:1000 w kropli medium Schneidera (najpierw rozcieńczyć 1:10 w medium Schneidera, a następnie dodać 0,5 μl do kropli na szkiełku), wymieszać i odczekać 10 sekund.</li>
<li>Usunąć nadmiar cieczy ze szkiełka, uważając, aby nie usunąć ommatidiów. Najlepiej wykonać to za pomocą cienkiej końcówki do nakładania żelu.</li>
<li>Dodać kroplę Vectashield, aby pokryć ommatidia, nałożyć szkiełko nakrywkowe i uszczelnić lakierem do paznokci.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki: 

Prawidłowe wykonanie protokołu powinno pozostawić liczbę pojedynczych ommatidiów oraz małych grup ommatidiów utrzymanych razem przez fragmenty lamina, ale wyraźnie oddzielonych od strony rogówki. Można je obrazować, jak w tym przykładzie, aby zwizualizować Atg8:GFP i Lysotracker, ukazując autofagosomy, lizosomy i autofagolizosomy (Rys. 3). Metodę tę można stosować do obrazowania na żywo, jednak w tym przypadku należy zauważyć, że autofluorescencja medium Schneidera utrudni rozróżnienie sygnałów fluorescencyjnych o niskim natężeniu. Dodatkowym problemem jest fakt, że ziarna pigmentu pozostające przy fotoreceptorach wykazują intensywną fluorescencję, szczególnie w kanale czerwonym. Może być wymagane zdjęcie w świetle przechodzącym, aby odróżnić je od rzeczywistych organelli.
<img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig1.jpg" alt="Schemat procesu sekcji muchy przedstawiający etapy przygotowania i obrazowania siatkówki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Schemat procedury sekcji w celu uzyskania pojedynczych ommatidiów lub małych grup ommatidiów z siatkówki muchy. 
<img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig2.jpg" alt="Schemat blokowy preparowania ommatidiów powiązany z technikami mozaikowymi, starzeniem, barwieniem i obrazowaniem." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Możliwe wariacje prostego protokołu opisanego w niniejszym materiale obejmują genetykę much i starzenie przed etapem preparowania i barwienia lub hodowlę do 24 godzin oraz podawanie leków po etapie preparowania.
<img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig3.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna, GFP:Atg8 i LysoTracker, analiza autofagii, wyniki obrazowania komórkowego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3. Skan konfokalny autofagosomów i lizosomów w pojedynczym ommatidium wyizolowanym z muchy w; GMR-Gal4, UAS-Atro75QN; UAS-GFP::Atg8/+, wykazującej ekspresję mutanta Atrophin z poliglutaminą i utrzymywanej przez 12 dni w temperaturze 29°C. Panel w świetle widzialnym (prawy górny róg) przedstawia niemal nienaruszoną strukturę ommatidium, a ramka wskazuje obszar skanowania. Kolor czerwony oznacza lizosomy, zielony autofagosomy; autolizosomy, powstałe w wyniku fuzji obu organelli, mają kolor żółty. Groty strzałek wskazują dwa trwające procesy fuzji autofagosomów z lizosomami.

<ol><li>Marsh, J. L., Thompson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+in+the+study+of+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila in the study of neurodegenerative disease.</a> Neuron. 52, 169-178 (2006).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li>
<li>Nisoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+by+polyglutamine+Atrophin+is+not+rescued+by+induction+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration by polyglutamine Atrophin is not rescued by induction of autophagy.</a> Cell Death Differ. 17, 1577-1587 (2010).</li>
<li>Charroux, B., Fanto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+line+between+waste+disposal+and+recycling%3A+DRPLA+fly+models+illustrate+the+importance+of+completing+the+autophagy+cycle+for+rescuing+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The fine line between waste disposal and recycling: DRPLA fly models illustrate the importance of completing the autophagy cycle for rescuing neurodegeneration.</a> Autophagy. 6, 667-669 (2010).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+potassium+channels+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive potassium channels in Drosophila photoreceptors.</a> J Neurosci. 11, 3079-3095 (1991).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in neurosciences. 24, 251-254 (2001).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li>
<li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Dev Biol. 351, 128-1234 (2011).</li>
<li>Napoletano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+Atrophin+provokes+neurodegeneration+in+Drosophila+by+repressing+fat%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine Atrophin provokes neurodegeneration in Drosophila by repressing fat.</a> The EMBO journal. 30, 945-958 (2011).</li>
<li>Ravikumar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mTOR+induces+autophagy+and+reduces+toxicity+of+polyglutamine+expansions+in+fly+and+mouse+models+of+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease.</a> Nature. 36, 585-595 (2004).</li>
<li>Zou, S., Meadows, S., Sharp, L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+study+of+aging+and+oxidative+stress+response+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genome-wide study of aging and oxidative stress response in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13726-13731 (2000).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Przedstawiona tutaj dyssekcja pojedynczego ommatidium umożliwia gromadzenie głębszych informacji biologiczno-komórkowych na temat procesów takich jak neurodegeneracja, modelowanych w oku Drosophila. Neurony fotoreceptorowe są łatwiej dostępne niż inne neurony, a ich cytoplazma jest szczególnie obszerna, co czyni je odpowiednimi do badania dynamiki pęcherzyków w tych samych komórkach, które są skutecznie wykorzystywane w wielu modelach do ilościowego określania neurodegeneracji in vivo. Kluczowym aspekte...

<table><tbody><tr><td>Przenośny dozownik CO2</td><td>Flystuff</td><td>59-150</td><td>Dostępne również wkłady zamienne</td></tr><tr><td>Pinceta DUMONT nr 5</td><td>Agar Scientific</td><td>T5034</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko przedmiotowe z 3 wgłębieniami</td><td>EMS</td><td>71561-01</td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki</td><td>VWR international</td><td>HAMMHSB516-09</td><td></td></tr><tr><td>Medium Schneider&amp;rsquo;a</td><td>VWR international</td><td>733-1663</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red DND-99</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka Superfrost</td><td>VWR international</td><td>631-0108</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield z Dapi</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Kryszalki</td><td>VWR international</td><td>631-1336</td><td></td></tr></tbody></table>

disekcja i obrazowanie pojedynczego ommatidium drosophila

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

Muszka owocówka Drosophila melanogaster wniosła nieoceniony wkład w badania nad neuronauką i jest szeroko wykorzystywana jako model chorób neurodegeneracyjnych ze względu na swój potężny aparat genetyczny1. Oko muchy w szczególności stało się organem pierwszego wyboru w badaniach nad neurodegeneracją, będąc najbardziej dostępną i nieistotną dla przeżycia częścią układu nerwowego Drosophila. Jednak głównym mankamentem nienaruszonych oczu jest trudność w obrazowaniu zdarzeń wewnątrzkomórkowych, takich jak dynamika autofagii2, które są kluczowe dla zrozumienia neurodegeneracji, co wynika z intensywnej autofluorescencji pigmentu.
Niedawno wykorzystaliśmy metodę wypreparowywania i hodowli pojedynczych ommatidiów3, która okazała się kluczowa dla zrozumienia dysfunkcji autofagii w modelu muchy z zanikiem Dentatorubro-Pallidoluysian (DRPLA)3, 4.
Przedstawiamy obecnie szczegółowy opis tej techniki (Ryc. 1), zaadaptowanej z badań elektrofizjologicznych5, która prawdopodobnie znacznie poszerzy możliwości wykorzystania modeli much w badaniach nad neurodegeneracją. Metodę tę można dostosować do obrazowania żywych zdarzeń subkomórkowych oraz monitorowania skuteczności podawania leków do komórek fotoreceptorowych (Ryc. 2). W połączeniu z technikami mozaikowymi6-8 możliwe jest równoległe badanie odpowiedzi genetycznie zróżnicowanych komórek (Ryc. 2).

Czynnikiem ograniczającym wykorzystanie oka dorosłych Drosophila w badaniach nad neurodegeneracją i biologią komórki jest trudność w obrazowaniu procesów wewnątrzkomórkowych. Opisujemy metodę preparowania pojedynczych ommatidiów w celu utworzenia właściwej pierwotnej hodowli komórek neuronalnych, która może być poddawana działaniu leków oraz zaawansowanemu obrazowaniu.

Disekcja i obrazowanie pojedynczego ommatidium Drosophila

Muszka owocówka *Drosophila melanogaster* wniosła nieoceniony wkład w badania nad neuronauką i była szeroko wykorzystywana jako model chorób neurodegeneracyjnych...

Ogólnym celem tej procedury jest sekcja i obrazowanie pojedynczych osobników drosophila lub matia w celu badania zjawisk wewnątrzkomórkowych w modelach neurodegeneracji. Osiąga się to poprzez oddzielenie głowy muchy od reszty ciała, a następnie rozcięcie jej.Następnie z wnętrza głowy usuwa się mózg i pozostałe tkanki. Potem usuwa się kutykulę, a każdą siatkówkę przecina się na pół. Ostatnim krokiem procedury jest wycięcie warstwy O za pomocą igły wolframowej i umieszczenie jej na szkiełku przedmiotowym.W efekcie można uzyskać wyniki obrazujące cytoplazmatyczne organelle autofagiczne za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Główną zaletą tej techniki jest umożliwienie wysokorozdzielczej analizy biologii komórki w modelach neurodegeneracji u muszek owocówek (drosophila), które do tej pory oferowały w tej dziedzinie jedynie wgląd genetyczny, co dowodzi, że procedura ta może być różnorodna. Procedurę przeprowadził student studiów podyplomowych z mojego laboratorium przy pomocy Daniela Mackaya, technika histologii i mikroskopii w ośrodku.Aby rozpocząć, należy napełnić jedną studzienkę szklanego preparatu trzechstudzienkowego solą fosforanową (PBS), a następnie znieczulić much

single-drosophila-ommatidium-dissection-and-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Pojedyncze cięcie i obrazowanie Drosophila Ommatidium

U owadów oenocyty wytwarzają węglowodory kutykularne. Związki te chronią przed wysychaniem i ułatwiają komunikację chemiczną. W niniejszej pracy prezentujemy technikę sekcji stosowaną do izolacji oenocytów z dorosłych osobników Drosophila melanogaster oraz ilustrujemy, w jaki sposób preparat ten może zostać wykorzystany do badania genów zaangażowanych w syntezę węglowodorów.

Disekcja oenocytów u dorosłych Drosophila melanogaster

Metoda obrazowania pionowego opisana w tym protokole pozwala na szczegółową wizualizację biegunów rozwijającego się jaja Drosophila melanogaster.  Ten widok od początku zapewnia nową perspektywę na rozmieszczenie i morfologię wielu typów komórek w nabłonku pęcherzykowym.

Obrazowanie pionowe komór jajowych Drosophila

Jajnik Drosophila jest doskonałym modelem do badania rozwoju nisz komórek macierzystych. Chociaż metody preparowania jajników larwalnych i dorosłych zostały opublikowane, sekcje jajników poczwarki wymagają różnych technik, które nie zostały szczegółowo opublikowane. Tutaj przedstawiamy protokół preparowania, barwienia i montowania jajników poczwarki.

Rozwarstwienie i barwienie jajników poczwarki Drosophila

Ten protokół jest przeznaczony do obrazowania i analizy dynamiki orientacji komórek i wzrostu tkanek w nabłonku brzusznym Drosophila, gdy muszka owocowa przechodzi metamorfozę. Opisana tutaj metodologia może być zastosowana do badania różnych etapów rozwojowych, tkanek i struktur subkomórkowych u Drosophila lub innych organizmów modelowych.

Obrazowanie i analiza orientacji tkanek i dynamiki wzrostu w rozwijającym się nabłonku Drosophila w stadiach poczwarkowych

Przedstawione tutaj są szczegółowe metody preparowania i barwienia kropelkami lipidów enocytów u larw Drosophila przy użyciu BODIPY 493/503, barwnika fluorescencyjnego specyficznego dla kropelek lipidów.

Rozwarstwienie i barwienie kropelkami lipidów enocytów u larw Drosophila

Przedstawiono protokół, który pozwala na wizualizację nienaruszonego Drosophila melanogaster na dowolnym etapie rozwoju za pomocą tomografii mikrokomputerowej.

Obrazowanie całego zwierzęcia Drosophila melanogaster za pomocą tomografii mikrokomputerowej

Tutaj udostępniamy protokół sekcji wymagany do zobrazowania na żywo późnej embrionalnej męskiej gonady Drosophila. Protokół ten pozwoli na obserwację dynamicznych procesów komórkowych w normalnych warunkach lub po manipulacji transgenicznej lub farmakologicznej.

Sekcja i obrazowanie na żywo późnej embrionalnej gonady Drosophila

U Drosophila, jądro oocytu ulega migracji zależnej od mikrotubul podczas oogenezy. W tym miejscu opisujemy protokół, który został opracowany w celu śledzenia migracji poprzez wykonywanie obrazowania na żywo w komorach jajowych ex vivo. Nasza procedura utrzymuje komory jajowe przy życiu przez 12 godzin, aby uzyskać wielopozycyjne filmy poklatkowe 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem.

Migracja jądrowa w oocycie Drosophila

Tutaj prezentujemy szybki, tani proces obrazowania w wysokiej rozdzielczości oczu dorosłego Drosophila w celu ilościowego określenia wzorców i wad wzrostu. Opisujemy nasz protokół przygotowania próbek poprzez montaż punktowy, akwizycję obrazu w wysokiej rozdzielczości i analizę obrazu.

Szybki i prosty proces oznaczania ilościowego zewnętrznych struktur dorosłego osobnika Drosophila

Drosophila to potężny model do zrozumienia podstawowych mechanizmów miogenezy. Ten protokół do sekcji i przygotowania przecięć półklatki piersiowej umożliwia mikroskopową analizę mięśni pośrednich lotów zarówno w stadium poczwarki, jak i dorosłych. Protokół ten umożliwia konfokalne obrazowanie morfologii komórkowej, lokalizacji białek, struktury mięśni oraz wielu innych aspektów miogenezy.

Rozwarstwienie pośrednich mięśni lotu Drosophila melanogaster do podejść mikroskopowych

Poznaj metodę rozwarstwiania i obrazowania pojedynczych ommatidiów Drosophila w celu badania zdarzeń wewnątrzkomórkowych w modelach neurodegeneracyjnych. Technika umożliwia tworzenie pierwotnych kultur neuronowych do analizy farmakologicznej.

Disekcja i obrazowanie pojedynczego ommatidium Drosophila

Przeglądaj więcej filmów