Name: Ekstrakcja DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z mat mikrobiologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-07T12:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Poznaj protokół ekstrakcji DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z mat mikrobiologicznych. Metoda poprawia jakość i stężenie DNA poprzez separację komórek mikroorganizmów przed izolacją.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca została sfinansowana przez National Science Foundation Environmental Genomics Program (Grant nr EF-0723707).

1. Ekstrakcja komórek drobnoustrojów:
<ol>
<li>Zhomogenizować maty mikrobiologiczne za pomocą sterylnego tłuczka do rozcierania, dokładnie mieszając. Przenieść około wszystkich 30 g (masy mokrej) zhomogenizowanego materiału maty do sterylnego pojemnika blendera Waring, dodać około 100 mL 1 M NaCl (lub stężenie specyficzne dla używanej próbki) i blendować trzy razy na średnich obrotach przez 1 min, z przerywanym chłodzeniem w zamrażarce w temperaturze -20°C przez 1 min. Przenieść zawiesinę do butelki wirówkowej o pojemności 250 mL i uzupełnić pozostałą wolną objętość roztworem 1 M NaCl. Roztwór NaCl przygotować w autoklawowanej wodzie DI i wysterylizować przez filtrację.</li> 
<li>Dalszo oddzielić komórki mikrobiologiczne od macierzy poprzez wstrząsanie (150 rpm) przy użyciu vortexera (Vortex-GenieR2) w temperaturze pokojowej przez 30 min.</li> 
<li>Wirować z niską prędkością (500x g) przez 15 min w temperaturze 4°C. Ostrożnie przenieść nadsącz do kolby, minimalizując wzburzenie osadu.</li>
<li>Wykorzystując osad z pelletu, powtórzyć blendowanie oraz kroki 1.2 i 1.3 jeszcze cztery razy, dodając świeży NaCl do każdego pelletu osadu na koniec kroku 1.3. Nadsącz z każdej ekstrakcji NaCl należy przenieść do nowej kolby.</li>
<li>Połączyć nadsącze z 5 ekstrakcji komórek i wirować w aliquotach po 200 mL z wysoką prędkością (25 000x g) przez 15 min w temperaturze 4°C. Odlać nadsącz, resuspendować każdy pellet komórkowy w 10 mL 2% heksametafosforanu sodu, połączyć pellety i uzupełnić objętość do 200 mL 2% heksametafosforanem sodu. Przemyć komórki poprzez wstrząsanie (150 rpm) w temperaturze pokojowej przez 30 min. Na koniec tego kroku powinna pozostać tylko jedna probówka z komórkami, aby przejść do następnego etapu.</li>
<li>Wirować z wysoką prędkością (25 000x g) przez 15 min w temperaturze 4°C. Odlać nadsącz, resuspendować pellet komórkowy w 200 mL buforu TE (50 mM EDTA) i przemyć komórki poprzez wstrząsanie (150 rpm) w temperaturze pokojowej przez 10 min.</li> 
<li>Wirować z wysoką prędkością (25 000x g) przez 15 min w temperaturze 4°C, odlać nadsącz, resuspendować w 15 mL buforu TE (10 mM EDTA) i przechowywać aliquoty po 200 µL w temperaturze -80°C do czasu przeprowadzenia ekstrakcji DNA.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja i oczyszczanie DNA:
<ol>
<li>Do 200-μL aliquoty komórek drobnoustrojów dodać 200 μL 5 M NaCl, 200 μL 10% SDS oraz 100 μL 14.3 M β-merkaptoetanolu. Pomieszać delikatnie, odwracając probówkę 4-6 razy.</li> 
<li>Mieszaninę poddać 3 cyklom zamrażania i rozmrażania poprzez zanurzenie w ciekłym azocie na 2 min, a następnie rozmrażanie w kąpieli wodnej o temperaturze 65°C przez 5 min. Ostatnie rozmrażanie wydłużyć do 10 min.</li> 
<li>Dodać 200 μL 5 M octanu potasu (pH 5.5) i pozostawić na lodzie na 10 min. Wirować przy 10,000x g przez 10 min w temperaturze 4°C, a następnie przenieść nadsącz do nowej probówki, używając końcówki do pipety o szerokim otworze. Dodać 3 μL RNazy A i inkubować w 37°C przez 1 h.</li>
<li>Dodać taką samą objętość chloroformu, krótko wstrząsnąć poprzez odwracanie i wirować przy 15,000x g przez 10 min w temperaturze pokojowej.</li> 
<li>Ostrożnie przenieść górną warstwę nadsączu do nowej probówki, używając końcówki do pipety o szerokim otworze. Należy unikać pobierania białej warstwy granicznej znajdującej się między warstwą górną a dolną. Powtórzyć procedurę ekstrakcji chloroformem.</li>
<li>Do nadsączu dodać taką samą objętość schłodzonego (do -20°C) izopropanolu i inkubować na lodzie przez 30 min w celu wytrącenia DNA.</li>
<li>Wirować z maksymalną prędkością (20,800x g) przez 10 min w 4°C, aby uzyskać osad DNA.</li>
<li>Usunąć nadsącz i przemyć osad DNA 1 mL schłodzonego (do -20°C) 70% etanolu.</li>
<li>Wirować z maksymalną prędkością (20,800x g) przez 10 min w 4°C, usunąć nadsącz, powtórzyć przemywanie 70% etanolem, a następnie suszyć osad DNA na powietrzu przez 10 min. Ponownie przemyć 70% etanolem.</li>
<li>Resuspendować DNA w 25 μL buforu TE (10 mM EDTA), ogrzewać w 65°C przez 5 min, połączyć zawartość w jednej probówce (jeśli użyto kilku) i uzupełnić objętość do 500 μL buforem TE.</li>
<li>Dodać 500 μL lodowatego (lub w 4°C) 20% glikolu polietylenowego (PEG) (przygotowanego w 1.2 M NaCl). Pomieszać delikatnie przez odwracanie, inkubować na lodzie przez 10 min i wirować z maksymalną prędkością przez 10 min w 4°C, aby uzyskać osad DNA. Usunąć nadsącz i przemyć osad DNA 1 mL schłodzonego 70% etanolu, suszyć na powietrzu przez 10 min i resuspendować w 30-50 μL buforu TE lub wody klasy molekularnej. Aby ułatwić resuspensję DNA, ogrzewać przez 5 min w 65°C. Przechowywać DNA w -80°C.</li> 
</ol>
3. Oznaczanie czystości, stężenia i wielkości DNA:
<ol>
<li>Oceń jakość DNA, mierząc stosunki A260/280 oraz A260/230 za pomocą spektrofotometru Nanodrop 1000 lub innego odpowiedniego urządzenia.</li>
<li>Wyznacz stężenie DNA przy użyciu zestawu Quant-iT dsDNA Assay zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
<li>Oceń wielkość DNA za pomocą elektroforezy w żelu w polu impulsowym. Przygotuj 1% żel agarozowy z 0,5X TBE i zastosuj następujące parametry w systemie CHEF Mapper XA: początkowy czas przełączania 0,35 s, końcowy czas przełączania 7,67 s oraz kąt rozwarcia 120° dla gradientu 6,0 V/cm przy liniowym współczynniku narastania. Barwi żel roztworem 1 x SYBR Green I przez 30 min. Na żel nanieś od 700 do 1000 ng całkowitej ilości DNA. Skróconą formę pełnego protokołu przedstawiono na Ryc. 3.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki:
Ekstrakcja komórek:
Sekwencyjne ekstrakty komórek drobnoustrojów (nady Żądania) wykazały, że mętność ekstraktów zmniejsza się wraz ze wzrostem liczby ekstrakcji. Sugeruje to redukcję liczby komórek po każdej kolejnej ekstrakcji komórkowej. Należy zwrócić uwagę, że ponieważ każdy dodatkowy etap ekstrakcji komórek stwarza możliwość wprowadzenia zanieczyszczeń, liczbę ekstrakcji komórek należy zminimalizować, aby końcowy osad komórkowy był reprezentatywny dla całej społeczności drobnoustrojów. Inne źródła kontaminacji kontrolowano poprzez zastosowanie odpowiednich laboratoryjnych technik sterylnych. Na przykład roztwory przygotowywano w autoklawowanej wodzie DI i sterylizowano przez filtrację. Pojemniki sterylizowano alkoholem, autoklawowano oraz naświetlano światłem UV i w urządzeniu do sieciowania UV.
Oznaczanie stężenia i jakości DNA:
Protokół pozwolił na uzyskanie około 2 μg HMW DNA (35-50 kb) (Ryc. 4) z jednego grama próbki maty, przy stosunku A260/280 wynoszącym 1,6 oraz stosunku A260/230 wynoszącym 0,7 (Tabela 1). Chociaż stosunek A260/230 wydawał się niski, w osobnym badaniu7 nie zaobserwowano zahamowania późniejszych zastosowań molekularnych, takich jak amplifikacja PCR genów 16S rRNA. Należy zauważyć, że DNA z mat hipersalnych posiada dwa główne źródła zanieczyszczeń: EPS oraz sole. Jest zatem możliwe, że ślady tych zanieczyszczeń wpływają na stosunki A260/230, pomimo ogromnych wysiłków w celu ograniczenia ich wpływu na dalsze analizy.
Oznaczanie wielkości DNA:
Elektroforeza w polu impulsowym wykorzystuje pulsujący przepływ prądu z przerywanymi zmianami kierunku, co skutkuje powstaniem smużki DNA, jak pokazano na rysunku 3. Nasz protokół pozwolił na uzyskanie HMW DNA o wielkości około 35-50 kb. Choć część fragmentów DNA może być mniejsza niż 30 kb, istotne jest, aby część smużki znajdowała się powyżej 35 kb, ponieważ klonowanie fosmidów wymaga wstawek DNA o wielkości ˜40 kb, a większe fragmenty DNA zapewniają lepszy dostęp do nienaruszonych szlaków biosyntetycznych. W naszych badaniach smużkę DNA powyżej 35 kb wycinano i oczyszczano w celu klonowania wektorów z dużymi wstawkami oraz do innych zastosowań molekularnych.
<img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig1.jpg" alt="Ekosystem mokradłowy wykazujący równowagę statyczną w naturze. Schemat równowagi ekologicznej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Miejsce poboru próbek z hipersolnych mat mikrobiologicznych (Big Pond) znajdujące się na wyspie Eleuthera na Bahamach.
<img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig2.jpg" alt="Przekrój warstwowej próbki żywności ukazujący teksturę i skład w badaniu mikroskopowym." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Przekrój poprzeczny hipersolnej maty mikrobiologicznej wykorzystanej w niniejszym badaniu. Mata mikrobiologiczna została pobrana z hipersolnego stawu znajdującego się na wyspie Eleuthera na Bahamach.
<img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig3.jpg" alt="Schemat lizy komórek i oczyszczania DNA; etapy: ekstrakcja komórek, usuwanie zanieczyszczeń, precypitacja DNA." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Schematyczne przedstawienie procedur obejmujących ekstrakcję komórek mikrobiologicznych, lizę komórek, ekstrakcję oraz oczyszczanie metagenomicznego DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2887/2887fig3large.jpg">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>
<img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig4.jpg" alt="Schemat żelu do elektroforezy DNA, pokazujący prążki przy 19,4 kb i 48,5 kb, wskazujące na wielkość DNA." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Charakterystyka masy cząsteczkowej wyekstrahowanego DNA z wykorzystaniem elektroforezy w polu pulsacyjnym. Ścieżka M to marker HMW, a ścieżki 1 i 2 to powtórzenia metagenomicznego DNA wyekstrahowanego z maty hipersolonej z Eleuthera zgodnie z powyższym protokołem.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Metoda ekstrakcji</td>
			<td> </td>
			<td>Stężenie ng/g</td>
			<td>A260/280</td>
			<td>A260/230</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG</td>
			<td>Powtórzenie 1</td>
			<td>1806.1</td>
			<td>1.64</td>
			<td>0.76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>Powtórzenie 2</td>
			<td>2010.8</td>
			<td>1.61</td>
			<td>0.75</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Pomiar stężenia i jakości DNA wyekstrahowanego z mikrobiologicznej maty hipersolnej.

<ol><li>Decho, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms+in+intertidal+systems%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Cont.+Shelf+Res%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms in intertidal systems: an overview.</a> Cont. Shelf Res. 20, 1257-1273 (2000).</li>
<li>Dupraz, C., Visscher, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+lithification+in+marine+stromatolites+and+hypersaline+mats%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial lithification in marine stromatolites and hypersaline mats.</a> Trends Microbiol. 13, 429-438 (2005).</li>
<li>Steffan, R. J., Goksoyr, J., Boj, A. K., Atlas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+DNA+from+soils+and+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Recovery of DNA from soils and sediments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 2908-2915 (1988).</li>
<li>Lee, Y. K., Kim, H. W., Liu, C. L., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+DNA+extraction+from+marine+bacteria+that+produce+extracellular+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for DNA extraction from marine bacteria that produce extracellular materials.</a> J. Microbiol. Methods. 52, 245-250 (2003).</li>
<li>Roose-Amsaleg, C. L., Garnier-Sillam, E., Harry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+Purification+of+Microbial+DNA+from+Soil+and+Sediment+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Soil+Ecol%22%5BJournal%5D)">Extraction and Purification of Microbial DNA from Soil and Sediment Samples.</a> Appl. Soil Ecol. 18, 47-60 (2001).</li>
<li>de Lipthay, J. R., Enzinger, C., Johnsen, K., Aamand, J., Sørensen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+DNA+extraction+method+on+bacterial+community+composition+measured+by+denaturing+gradient+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Impact of DNA extraction method on bacterial community composition measured by denaturing gradient gel electrophoresis.</a> Soil Biol. Biochem. 36, 1607-1614 (2004).</li>
<li>Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+High+Molecular+Weight+DNA+from+Microbial+Mats%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats.</a> Biotechniques. 49, 631-640 (2010).</li>
<li>Kakirde, S. K., Parsley, L. C., Liles, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+does+matter%3A+Application-driven+approaches+for+soil+metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+%26+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Size does matter: Application-driven approaches for soil metagenomics.</a> Soil Biology & Biochemistry. 42, 1911-1923 (2010).</li>
<li>Rodon, M. R., August, P. R., Bettermann, A. D., Brady, S. F., Grossman, T. H., Liles, M. R., Loiacono, K. A., Lynch, B. A., MacNeil, I. A., Minor, C., Tiong, C. L., Gilman, M., Osburne, M. S., Clardy, J., Handelsman, J., Goodman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+the+Soil+Metagenomic%3A+A+Strategy+for+Accessing+the+Genetic+and+Functional+Diversity+of+Uncultured+Microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cloning the Soil Metagenomic: A Strategy for Accessing the Genetic and Functional Diversity of Uncultured Microorganisms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66, 2541-2547 (2000).</li>
<li>Beja, O., Aravind, L., Koonin, E. V., Suzuki, M. T., Hadd, A., Nguyen, L. P., Jovanovich, S. B., Gates, C. M., Feldman, R. A., Spudich, J. L., Spudich, E. N., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Rhodopsin%3A+Evidence+for+a+New+Type+of+Phototrophy+in+the+Sea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Rhodopsin: Evidence for a New Type of Phototrophy in the Sea.</a> Science. 289, 1902-1906 (2000).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Z uwagi na to, że całkowite usunięcie komórek z kompleksowych i wysoce zróżnicowanych próbek mat mikrobiologicznych nie jest praktyczne, głównym problemem jest to, w jakim stopniu wyekstrahowane komórki reprezentują ogólną społeczność maty mikrobiologicznej. W poprzednim badaniu analiza PCR-DGGE genów 16S rRNA mikroorganizmów wykazała, że pięć etapów usuwania komórek zastosowanych w niniejszym protokole pozwala na ekstrakcję komórek reprezentatywnych dla ogólnej społeczności maty mikrobiologicznej7. Rzeczywist...

<table><tbody><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy 8000</td><td>Promega Corp.</td><td>V3011</td><td>20% w 1.2 M NaCl</td></tr><tr><td>Octan potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Zestaw Quant-iT dsDNA Assay</td><td>Invitrogen</td><td>Q33130</td><td></td></tr><tr><td>RNaza</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>MRNA092</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>VWR</td><td>BDH8014</td><td>Odpowiednie stężenie</td></tr><tr><td>Dodecylsiarczan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-500-509</td><td>10% w wodzie</td></tr><tr><td>heksametafosforan sodu</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0583-3</td><td>2% w wodzie</td></tr><tr><td>TBE</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1333-1</td><td></td></tr><tr><td>System CHEF Mapper XA</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3670</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop 1000</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Scientific Industries Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kroslinker UV</td><td>UVP Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blender Waring</td><td>Waring Laboratory</td><td>LB10S</td><td></td></tr></tbody></table>

ekstrakcja wysokocząsteczkowego dna z mat mikrobowych

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Skuteczna i dokładna analiza oraz interpretacja danych metagenomicznych zależą od efektywnej ekstrakcji wysokiej jakości DNA społeczności o wysokiej masie cząsteczkowej (HMW). Jednakże próbki mat środowiskowych często utrudniają uzyskanie dużych stężeń wysokiej jakości DNA typu HMW. Hipersalinowe maty mikrobiologiczne zawierają duże ilości zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych (EPS)1 oraz soli, które mogą hamować dalsze zastosowania ekstrahowanego DNA. W ekstrakcji DNA z próbek opornych często stosuje się metody bezpośrednie i agresywne. Metody te są zazwyczaj wykorzystywane, ponieważ EPS w matach, stanowiące lepka macierz, wiążą DNA2,3 podczas bezpośredniej lizy. W wyniku stosowania bardziej agresywnych metod ekstrakcji, DNA ulega fragmentacji do małych rozmiarów4,5,6.
W ten sposób DNA staje się nieprzydatne do klonowania w wektorach dla dużych insertów. Aby obejść te ograniczenia, przedstawiamy ulepszoną metodologię ekstrakcji wysokocząsteczkowego (HMW) DNA o dobrej jakości i ilości z hipersalnych mat mikrobiologicznych. Zastosowaliśmy metodę pośrednią polegającą na oddzieleniu komórek mikrobiologicznych od macierzy maty poprzez blendowanie i centryfugację różnicową. Do ekstrakcji i oczyszczania DNA z wydzielonych komórek mikrobiologicznych wykorzystano kombinację procedur mechanicznych i chemicznych. Nasz protokół pozwala na uzyskanie około 2 μg HMW DNA (35-50 kb) z jednego grama próbki maty, przy stosunku A260/280 wynoszącym 1,6. Ponadto amplifikacja genów 16S rRNA7 sugeruje, że protokół ten pozwala zminimalizować lub wyeliminować jakiekolwiek działanie inhibicyjne zanieczyszczeń. Nasze wyniki dostarczają odpowiedniej metodologii ekstrakcji HMW DNA z mat mikrobiologicznych na potrzeby funkcjonalnych badań metagenomicznych i mogą mieć zastosowanie w przypadku innych próbek środowiskowych, z których ekstrakcja DNA jest problematyczna.

Przedstawiamy ulepszony protokół izolacji wysokocząsteczkowego DNA z hipersalinitycznych mat mikrobjalnych. Przed ekstrakcją i puryfikacją DNA komórki mikrobjalne są oddzielane od macierzy maty. Pozwala to na zwiększenie stężenia, poprawę jakości oraz zwiększenie rozmiaru DNA. Protokół ten może być stosowany również w przypadku innych próbek trudnych do obróbki.

Ekstrakcja wysokocząsteczkowego DNA z mat mikrobowych

Skuteczna i dokładna analiza oraz interpretacja danych metagenomicznych zależą od efektywnej ekstrakcji wysokiej jakości kwasów nukleinowych o wysokiej masie cząsteczkowej ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie wysokocząsteczkowego DNA z hipersalnych mat mikrobiologicznych. Osiąga się to poprzez uprzednią homogenizację i ekstrakcję komórek mikrobiologicznych z maty mikrobiologicznej. Następnie komórki mikrobiologiczne poddaje się lizie, wykorzystując metodę zamrażania i rozmrażania oraz metodologię chemiczną.Następnie, przy użyciu ekstrakcji organicznych i RNaz, usuwa się szczątki komórkowe oraz RNA, po czym następuje ekstrakcja DNA. Ostatnim etapem procedury jest wytrącanie i oczyszczanie DNA. W rezultacie można uzyskać DNA o wysokiej masie cząsteczkowej oraz odpowiedniej jakości i stężeniu.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak bezpośrednie i drastyczne metody ekstrakcji DNA, jest możliwość wykorzystania DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z złożonej próbki środowiskowej do funkcjonalnych badań metagenomicznych. Materiał mikrobiologiczny wykorzystany w tej pracy pobrano ze stawu hipersolnego znajdującego się na wyspie Eleuthera na Bahamach. Aby wyekstrahować komórki mikrobiologiczne z macierzy maty, należy najpierw dokładnie wymieszać około 30 gramów maty, nie mieląc jej, za pomocą sterylnego tłuczka. Matę uznaje się za całkowicie zhomogenizowaną, gdy w mieszaninie nie widać już żadnych grudek.Następnie umieść zhomogenizowany materiał matowy w blenderze i dodaj około 100 mililitrów chlorku sodu. Blenduj na średnich obrotach przez jedną minutę, a następnie chłodź przez jedną minutę w temperaturze -20 °C. Powtórz ten proces blendowania i chłodzenia jeszcze dwukrotnie. Po zakończeniu blendowania przelej zawiesinę do butelki wirówki o pojemności 250 mililitrów i uzupełnij pozostałą wolną przestrzeń jednomolowym chlorkiem sodu.Wstrząsać w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie wirować zawiesinę z niską prędkością przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie przenieść nadsącz do kolby, unikając zaburzenia osadu. Do osadu w postaci pelletu dodać świeży chlorek sodu.Ponownie wymieszaj i wstrząsaj przez 30 minut. Następnie odwiruj w wirówce w ten sam sposób co poprzednio i przelej nadsącz do nowej kolby. Powtórz dodawanie świeżego chlorku sodu, mieszanie, wirowanie oraz usuwanie nadsączu jeszcze trzykrotnie.Połączyć nadnadstania z pięciu ekstrakcji komórkowych i odwirować alikwoty o objętości 200 mililitrów z dużą prędkością przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odlać nadnadstanie i resuspender każdy osad komórkowy w 10 mililitrach heksametafosforanu sodu. Połączyć zawiesiny komórkowe ze wszystkich czterech probówek i dodać heksametafosforan sodu, aby dopełnić objętość do 200 mililitrów.Przemyj komórki, wytrząsając je w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po wytrząsaniu odwiruj komórki przy wysokiej prędkości przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, odlej nadsącz i resuspenduj osad komórkowy w 200 mililitrach buforu, aby ponownie przemyć komórki poprzez wytrząsanie w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Na koniec ponownie odwiruj próbkę przy wysokiej prędkości przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po odlaniu reszty zawiesiny, zawiesić osad komórkowy w 15 mililitrach TE, a następnie przygotować alikwoty komórek mikrobiologicznych o objętości 200 mikrolitrów. Komórki mikrobiologiczne można przechowywać w temperaturze -80°C do czasu przeprowadzenia ekstrakcji DNA. Aby rozpocząć procedurę ekstrakcji i oczyszczania DNA z komórek mikrobiologicznych, do każdej 200-mikrolitrowej porcji komórek dodać NaCl, SDS oraz bezwodny etanol.Rozdziel próbki do łącznie ośmiu probówek. Delikatnie wymieszaj, odwracając probówki od czterech do sześciu razy, zanurz mieszaninę w ciekłym azocie na dwie minuty, a następnie rozmroź w temperaturze 65 °C przez pięć minut; powtórz cykl zanurzania w ciekłym azocie i rozmrażania w temperaturze 65 °C jeszcze dwa razy.Wydłużenie końcowego rozmrażania do 10 minut. Po trzeciej serii zamrażania i rozmrażania do każdej probówki należy dodać 200 µL octanu potasu i pozostawić na lodzie przez 10 minut. Następnie odwiruj próbki przy 10 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.Następnie, używając końcówki do pipety o szerokim otworze, przenieś supernatant do nowej probówki. Dodaj 3 µL RNAs A i inkubuj w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Po godzinnej inkubacji dodaj równą objętość chloroformu.Krótko wstrząsnąć metodą odwracania i wirować przy 15 000 Gs przez 10 minut. W temperaturze pokojowej przenieść górną warstwę supernatantu do nowej probówki. Powtórzyć procedurę ekstrakcji chloroformem.Ponownie przenieś górną warstwę supernatantu do nowej probówki. Dodaj do supernatantu taką samą objętość schłodzonego izopropanolu i inkubuj na lodzie przez 30 minut. Aby wytrącić DNA, odwiruj próbkę przy maksymalnej prędkości, odlej supernatant i przemyj każdy osad DNA jednym mililitrem schłodzonego 70% ethanol.Powtórzyć przemywanie 70% etanolem, wirując z maksymalną prędkością przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odlać nadsącz. Ponowić przemywanie 70% etanolem, a następnie suszyć osad DNA na powietrzu przez 10 minut.Każdy osad DNA zawiesić w około 25 µL buforu te. Podgrzewać w temperaturze 65 °C przez pięć minut, następnie połączyć w jednej probówce i uzupełnić objętość do 500 µL buforem te. Dodać glikol polietylenowy, delikatnie mieszając przez odwracanie probówki, i inkubować na lodzie przez 10 minut.Odwiruj próbkę, abyt sfałokować DNA. Następnie odlej i usuń nadsącz po przemyciu DNA schłodzonym 70% ethanol. Susz na powietrzu przez 10 minut, po czym resuspenduj w 30 do 50 microliters TE lub wody klasy molekularnej i inkubuj w temperaturze 65 degrees Celsius przez pięć minut.Przechowywać DNA w temperaturze -80 °C. W poniższej tabeli przedstawiono wyniki pomiarów stężenia i jakości DNA wyizolowanego z mikrobiologicznej maty hipersolnej. Protokół pozwolił na uzyskanie około 2 µg DNA na gram próbki maty, przy stosunku A260/280 wynoszącym 1,6 oraz stosunku A260/230 wynoszącym 0,7.Choć stosunek A 260 do 230 wydawał się niski, w oddzielnym badaniu nie zaobserwowano inhibicji w dalszych zastosowaniach opartych na metodach molekularnych, takich jak amplifikacja PCR genów 16 s rRNA; gdy wielkość DNA określono za pomocą elektroforezy w polu impulsowym, wyniki wskazały na wysoką masę cząsteczkową, czyli H-M-W-D-N-A, o wielkości około 35 do 50 kb. Tutaj ścieżka M to marker HMW, a ścieżki 1 i 2 to powtórzenia metagenomicznego DNA wyekstrahowanego z hiperzasolonej maty eleuthra. Rozmaz DNA powyżej 35 kb można wyciąć i oczyścić w celu klonowania w wektorach do dużych insertów lub w innych odpowiednich zastosowaniach molekularnych.Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak klonowanie P-C-R-D-G-G-E lub sekwencjonowanie DNA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące różnorodności funkcjonalnej badanej społeczności mikroorganizmów.

extraction-of-high-molecular-weight-dna-from-microbial-mats

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z mikrobiologicznych materii organicznych

Opisujemy metodę ekstrakcji genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z biomasy planktonicznej skoncentrowanej na filtrach Sterivex 0.22 μm, a następnie oczyszczania go za pomocą wirowania w gradiencie gęstości chlorku cezu.

Ekstrakcja DNA z filtrów Sterivex 0,22 $\mu$M oraz wirowanie w gradiencie gęstości chlorku cezu

Opisano metodologię izolacji wysokiej jakości genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z mikrobiologicznej społeczności glebowej.

Ekstrakcja wysokocząsteczkowego genomowego DNA z gleb i osadów

W niniejszym filmie zaprezentowano protokół ekstrakcji DNA z materiału utrwalonego w formalinie i zatopionego w parafinie. Jest to procedura wielodniowa, w ramach której skrawki tkanek są deparafinowane ksylenem, rehydratowane etanolem i traktowane proteinazą K w celu oczyszczenia i wyizolowania DNA do późniejszej analizy genowo-specyficznej lub całego genomu.

Ekstrakcja DNA z materiału zatopionego w parafinie do analiz genetycznych i epigenetycznych

Korzystając z przykładu dróg oddechowych mukowiscydozy, manuskrypt przedstawia kompleksowy przepływ pracy obejmujący kombinację podejść metagenomicznych i metatranskryptomicznych w celu scharakteryzowania społeczności mikrobiologicznych i wirusowych w próbkach związanych ze zwierzętami.

Oczyszczanie nieczystości: sekwencjonowanie metagenomów i metatranskryptomów ze złożonych próbek związanych ze zwierzętami

Opisana tutaj jest metoda ekstrakcji, oczyszczania i kontroli jakości genomowego DNA z obligatoryjnego biotroficznego patogenu grzybowego, mączniaka prawdziwego, do użycia w długotrwałym sekwencjonowaniu genomu.

Oczyszczanie genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z mączniaka prawdziwego do sekwencjonowania z długim odczytem

Przedstawiamy proces izolacji, rozmnażania i charakteryzowania bakterii rozkładających węglowodory z siedlisk wodnych. W protokole opisano izolację bakterii, identyfikację metodą 16S rRNA oraz badanie ich potencjału degradacji węglowodorów. Ten artykuł pomoże naukowcom w scharakteryzowaniu różnorodności biologicznej drobnoustrojów w próbkach środowiskowych, a w szczególności w badaniach przesiewowych pod kątem drobnoustrojów o potencjale bioremediacji.

Izolacja, rozmnażanie i identyfikacja gatunków bakterii o właściwościach metabolizowania węglowodorów z siedlisk wodnych

Ten artykuł opisuje protokół ekstrakcji DNA okrzemek przy użyciu zmodyfikowanego zestawu do ekstrakcji DNA powszechnie używanego.

Ekstrakcja DNA okrzemek z próbek wody i tkanek

Tutaj prezentujemy prostą technikę oceny środowiskowej oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) poprzez zwiększenie proporcji niskocząsteczkowego DNA zewnątrzkomórkowego. Wcześniejsze leczenie 20%-30% PEG i 1,2 M NaCl pozwala na wykrycie zarówno genomowych, jak i przenoszonych horyzontalnie genów AMR. Protokół nadaje się do procesu bez zestawów z dodatkową optymalizacją.

Ulepszona ekstrakcja DNA o niskiej masie cząsteczkowej ze ścieków w celu kompleksowej oceny oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe

Protokół ten opisuje metodę CTAB polegającą na wydobyciu wysokiej jakości DNA z mykobakterii, pokonując wyzwania związane z ich twardymi, bogatymi w kwas grzybniczy ściany komórkowe. Proces obejmuje trawienie enzymatyczne, lizę komórek za pomocą CTAB oraz oczyszczanie DNA poprzez ekstrakcję organiczną i wytrącanie etanolem. Ta metoda wytwarza DNA odpowiednie do badań molekularnych i jest wiarygodna w badaniach mykobakterialnych.

Ekstrakcja deoksyrybonukleinowym w całym genomie z gatunków Mycobacterium za pomocą techniki bromku cetylotrymetylamoniowego

Biologia społeczności mikrobiologicznych – wywiad

Poznaj protokół ekstrakcji DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z mat mikrobiologicznych. Metoda poprawia jakość i stężenie DNA poprzez separację komórek mikroorganizmów przed izolacją.

Ekstrakcja wysokocząsteczkowego DNA z mat mikrobowych

Przeglądaj więcej filmów