Name: Obrazowanie czasu życia fluorescencji wirników molekularnych w żywych komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Poznaj technikę FLIM do mapowania lepkości w żywych komórkach za pomocą fluorescencyjnych wirników molekularnych. Ta metoda pozwala wizualizować mikrośrodowiska komórkowe w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

M.K.K. dziękuje programowi Life Sciences Interface brytyjskiej Rady Badań nad Inżynierią i Naukami Fizycznymi (EPSRC) za osobisty stypendium fellowship. Chcielibyśmy również podziękować za finansowanie ze strony brytyjskiej Rady Badań nad Biotechnologią i Naukami Biologicznymi (BBSRC).

Protokoły przygotowania próbek do FLIM nie różnią się od protokołów stosowanych w konfokalnej lub szerokopolowej fluorescencyjnej mikroskopii intensywnościowej. Po akwizycji danych następuje główny etap analizy danych, t.j. wyznaczenie czasów życia fluorescencji z danych surowych. Po ich uzyskaniu interpretacja danych pozwala na weryfikację lub falsyfikację postawionych hipotez.
1. Barwienie komórek za pomocą rotorów molekularnych
<ol>
	<li>Przygotować roztwór zapasowy (10 ml) poprzez rozpuszczenie około 1 mg/ml barwnika w odpowiednim rozpuszczalniku (np. metanolu dla BODIPY-C12)6,7, używając precyzyjnej wagi oraz pipety.</li>
	<li>Komórki przeznaczone do barwienia (modelowa linia komórek nowotworowych, w naszym przypadku HeLa) hodować w płytce wielodołkowej z przeszklonym dnem do mikroskopii, w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 5 % CO2 aż do osiągnięcia konfluencji na poziomie ~ 80%.</li>
	<li>Do żywych komórek rosnących w płytce wielodołkowej (system mikroinkubacyjny SmartSlide 50, Wafergen) w 4 ml medium Opti-MEM (GIBCO) na dołek (dla płytki 6-dołkowej) dodać 10 - 20 μl roztworu zapasowego. Pozwala to uzyskać mikromolarną koncentrację barwnika w dołku.</li>
	<li>Umieścić płytkę wielodołkową ponownie w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 5 % CO2 na 10-45 min w celu przeprowadzenia barwienia.</li>
	<li>Wyjąć płytkę wielodołkową z inkubatora i przemyć komórki 3-4 razy 4 ml optycznie przezroczystego medium hodowlanego (np. Opti-MEM), aby usunąć nadmiar barwnika.</li>
	<li>Przenieść płytkę wielodołkową na stolik mikroskopu i, w razie potrzeby, podłączyć do kontrolera temperatury / wlotu gazu 5 % CO2 w celu przygotowania do obrazowania.</li>
</ol>
2. FLIM fluorescencyjnych rotorów molekularnych w komórkach
<ol>
	<li>Umieść próbkę na stole mikroskopu i wykonaj obraz w transmisji oraz fluorescencji, aby zidentyfikować komórki fluorescencyjne. Schematyczny rysunek układu eksperymentalnego przedstawiono na Rys. 1. Zweryfikuj, czy fluorescencja pochodzi z oczekiwanych lokalizacji (np. błona komórkowa, cytoplazma). Uzyskaj widmo emisji fluorescencji i potwierdź, że odpowiada ono oczekiwanemu barwnikowi lub białku, w tym przypadku widmu rotora molekularnego. Jako kontrolę negatywną wykonaj obraz próbki niebarwionej i sprawdź, czy nie wykazuje ona fluorescencji. Chociaż krok ten nie jest niezbędny konkretnie dla FLIM, jest to dobra praktyka ogólna, która pomaga potwierdzić tożsamość próbki.</li>
	<li>Przełącz na tryb FLIM – można to łatwo osiągnąć, przesuwając lustro poza drogę wiązki detekcji fluorescencji (przycisk „external detector” w panelu „beam path setting” w oprogramowaniu sterującym akwizycją Leica TCS SP2). W drodze wiązki detekcji fluorescencji musi znajdować się odpowiedni filtr emisji fluorescencji, aby zablokować dotarcie światła wzbudzającego do detektora.</li>
</ol>
<img alt="Schemat układu TCSPC z laserem impulsacyjnym do obrazowania czasu życia fluorescencji i analizy zaniku." src="/files/ftp_upload/2925/2925fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Układ eksperymentalny dla FLIM w dziedzinie czasu z wykorzystaniem konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego.
<ol start="3">
	<li>Przeskanuj próbkę i sprawdź na komputerze sterującym akwizycją FLIM, czy szybkość zliczania detektora (czarny pasek oznaczony CFD w oprogramowaniu sterującym akwizycją karty Becker &amp; Hickl SPC 830) nie przekracza około 1% częstotliwości repetycji lasera (zielony pasek oznaczony SYNC w oprogramowaniu sterującym akwizycją). Jeśli tak jest, zmniejsz intensywność wzbudzenia laserowego, np. poprzez umieszczenie filtra neutralnego w drodze wiązki lasera, aby uniknąć zbierania zniekształconych przez zjawisko pile-up krzywych zaniku fluorescencji.</li>
	<li>Wykonaj obraz FLIM, zazwyczaj przez 3-5 min, zatrzymaj skanowanie i zapisz surowe dane (3D „kostkę” danych składającą się ze współrzędnych przestrzennych x i y oraz czasu).</li>
	<li>Otwórz surowe dane w pakiecie oprogramowania do analizy zaniku fluorescencji, na przykład TRI-214 lub w oprogramowaniu komercyjnym, aby wyświetlić obraz intensywności fluorescencji. Jest to po prostu zintegrowany zanik fluorescencji, czyli pole pod krzywą zaniku fluorescencji w każdym pikselu.</li>
	<li>Wybierz typowy piksel, umieszczając na nim kursor, i sprawdź zanik fluorescencji w tym pikselu. Jeśli szczytowa liczba zliczeń jest mniejsza niż 10, zastosuj przestrzenne binowanie pikseli. Zliczenia z sąsiednich pikseli (np. 3x3 lub 5x5) są sumowane w pikselu centralnym, dzięki czemu uzyskuje się tam wyższą szczytową liczbę zliczeń. Zapewnia to wyższą dokładność statystyczną w następnym kroku. Alternatywnie pomiar można powtórzyć dla dłuższego czasu akwizycji (krok 5). Przy 30-50 min uzyskuje się około 10 razy wyższą liczbę zliczeń szczytowych (i całkowitych), ale jest to zbyt długi czas akwizycji dla większości próbek biologicznych ze względu na ryzyko wprowadzenia artefaktów wynikających z ruchu próbki, dryfu mikroskopu, fototoksyczności i fotoblaknięcia.</li>
	<li>Wybierz globalną wartość progu piksela (powyżej której dopasowywany jest zanik w pikselu) i zastosuj dopasowanie jednokrotnej funkcji wykładniczej do obrazu. Wynikiem jest czas życia fluorescencji dla każdego piksela powyżej progu, który jest następnie kodowany kolorami. Każdy piksel jest kolorowany zgodnie z wynikiem dopasowania, w ten sposób powstaje mapa FLIM. Sprawdź zredukowane wartości chi-kwadrat dla różnych pikseli – wartość około 1 (do 1,3) wskazuje na dobre dopasowanie. Sprawdź odpowiednie residua, które powinny być losowo rozłożone wokół zera.</li>
	<li>Histogram czasu życia fluorescencji przedstawia, jak często występują określone czasy życia fluorescencji w stosunku do samego czasu życia fluorescencji. Dostosuj zakres kolorów tak, aby rozkład czasu życia fluorescencji mieścił się w zakresie kolorystycznym.</li>
	<li>Jeśli dopasowanie monoeksponencjalne nie daje wartości chi-kwadrat w okolicy 1 (do 1,3) i występuje systematyczne odchylenie residuów od zera, wymagany jest bardziej zaawansowany model. Na przykład spróbuj dopasować model dwueksponencjalny do zaników fluorescencji, aby uwzględnić dwa różne środowiska, w których może znajdować się sonda. Dopasowanie to pozwoli również wyznaczyć czynniki przedwykładnicze lub amplitudy, które dają informację o względnej ilości barwnika w jednym lub drugim środowisku. Alternatywnie może być odpowiednia funkcja wykładnicza rozciągnięta, aby uwzględnić rozkład czasów życia fluorescencji.</li>
	<li>Wyniki dla czasów życia fluorescencji, czynników przedwykładniczych oraz stosunku czasów życia i stosunku czynników przedwykładniczych dla każdego piksela mogą zostać następnie zakodowane kolorami. Każdy piksel jest kolorowany zgodnie z jego wartością, co pozwala uzyskać kontrast wynikający z czasów życia fluorescencji, czynników przedwykładniczych i ich stosunków. Ponownie sprawdź zredukowane wartości chi-kwadrat (które również mogą być zakodowane kolorami i wyświetlone jako obraz) – wartość około 1 (do 1,3) wskazuje na dobre dopasowanie. Sprawdź residua, które powinny być losowo rozłożone wokół zera.</li>
	<li>Histogramom czasu życia fluorescencji powinny towarzyszyć wszystkie obrazy, aby ułatwić wizualizację średnich wartości czasu życia fluorescencji oraz rozkładu czasu życia fluorescencji.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki
Przesunięcia czasowe wygaszania fluorescencji zmierzone dla fluorescencyjnego molekularnego rotora przy zwiększającej się lepkości w mieszaninach metanolu i glicerolu przedstawiono na Rys. 2. Wygaszanie fluorescencji ma charakter monoeksponencjalny, a czas życia fluorescencji zmienia się znacząco w zależności od lepkości. Wzrasta on z około 30 ps w metanolu (lepkość 0.6 cP) do 3.4 ns w 95% glicerolu (lepkość 950 cP).
<img alt="Wykres zaniku intensywności fluorescencji; wpływ lepkości na czas zaniku; analiza spektroskopowa." src="/files/ftp_upload/2925/2925fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2. Profile zaniku fluorescencji dla BODIPY-C12 w mieszaninach metanolu i gliceryny o różnej lepkości.6
Logarytmiczny wykres kalibracyjny czasu życia fluorescencji τ w funkcji lepkości η dla fluorescencyjnego rotora molekularnego przedstawiono na Rys. 3. Jest to linia prosta, zgodnie z wymogami równania Förstera-Hoffmana9
<img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq1.jpg" alt="Wzór na czas relaksacji τ=z/k₀ηˣ; wyrażenie matematyczne do analizy dynamiki płynów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 1">
gdzie k0 jest radiacyjną stałą szybkości, a z i x są stałymi, przy czym 0&lt;x&lt;1. Logarytmowanie obu stron daje
<img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq2.jpg" alt="Równanie przedstawiające zależność lepkości w analizie polimerów, log τ=log(z/k₀)+x log η." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 2">
gdzie x jest nachyleniem linii prostej.
<img alt="wykres liniowej zależności log τ od log η; analiza trendów danych w badaniach naukowych." src="/files/ftp_upload/2925/2925fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3. Wykres zależności logarytmu czasu życia fluorescencji od logarytmu lepkości dla BODIPY-C12 daje linię prostą zgodnie z równaniem Förstera-Hoffmanna.6
Po inkubacji żywych komórek z fluorescencyjnym rotorem molekularnym na obrazach fluorescencji obserwuje się punktowy rozkład barwnika. Obrazy FLIM komórek HeLa inkubowanych z barwnikiem BODIPY z podstawieniem w pozycji meso przedstawiono na Rys. 4. Zanik fluorescencji w każdym pikselu obrazu można odpowiednio dopasować przy użyciu modelu pojedynczego wykładniczego zaniku.
<img alt="Mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji, obrazy komórkowe, mapa pseudokolorów, analiza wzbudzenia optycznego." src="/files/ftp_upload/2925/2925fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4. (a) Intensywność fluorescencji i (b) obrazy FLIM komórek HeLa barwionych BODIPY-C12Jasne, punktowe obszary wykazują krótszy czas życia niż pozostałe regiony. Ten krótszy czas życia odpowiada niższej lepkości w punktach, które prawdopodobnie są kroplami lipidowymi, zgodnie z równaniem Förstera-Hoffmanna.
Poprzez wykreślenie czasów życia wyekstrahowanych z każdego piksela otrzymujemy histogram czasu życia fluorescencji dla całego obrazu, jak pokazano na Rys. 5.
<img alt="Histogram częstotliwości czasu życia z krzywą dopasowania gaussowskiego, przedstawiający rozkład danych w badaniu spektroskopowym." src="/files/ftp_upload/2925/2925fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Histogramy czasów życia fluorescencji z obrazów FLIM komórek HeLa barwionych mezo-podstawionymi rotorami molekularnymi BODIPY.

<ol><li>Luby-Phelps, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoarchitecture+and+physical+properties+of+cytoplasm%3A+Volume%2C+viscosity.+diffusion%2C+intracellular+surface+area%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cytology+-+a+Survey+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: Volume, viscosity. diffusion, intracellular surface area.</a> International Review of Cytology - a Survey of Cell Biology. , 192-1189 (2000).</li>
<li>Stutts, M. J., Canessa, C. M., Olsen, J. C., Hamrick, M., Cohn, J. A., Rossier, B. C., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+as+a+CAMP-dependent+regulator+of+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CFTR as a CAMP-dependent regulator of sodium channels.</a> Science. 269, 847-850 (1995).</li>
<li>Dondorp, A. M., Angus, B. J., Hardeman, M. R., Chotivanich, K. T., Silamut, K., Ruangveerayuth, R., Kager, P. A., White, N. J., Vreeken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+reduced+red+blood+cell+deformability+in+severe+falciparum+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of reduced red blood cell deformability in severe falciparum malaria.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 507-511 (1997).</li>
<li>Haidekker, M. A., Nipper, M., Mustafic, A., Lichlyter, D., Dakanali, M., Theodorakis, E. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaidekker%2C+MA+%22Advanced+Fluorescence+Reporters+in+Chemistry+and+Biology+I.+Fundamentals+and+Molecular+Design%22">Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology I. Fundamentals and Molecular Design</a>. Demchenko, A. P. 8, Springer. Berlin Heidelberg. 267-308 (2010).</li>
<li>Haidekker, M. A., Theodorakis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environment-sensitive+behavior+of+fluorescent+molecular+rotors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Environment-sensitive behavior of fluorescent molecular rotors.</a> J. Biol. Eng. 4, (2010).</li>
<li>Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Levitt, J. A., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Rotor+Measures+Viscosity+of+Live+Cells+via+Fluorescence+Lifetime+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Molecular Rotor Measures Viscosity of Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 6672-6673 (2008).</li>
<li>Levitt, J. A., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Chung, P. H., Suhling, K., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-Bound+Molecular+Rotors+Measure+Viscosity+in+Live+Cells+via+Fluorescence+Lifetime+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+C%22%5BJournal%5D)">Membrane-Bound Molecular Rotors Measure Viscosity in Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Journal of Physical Chemistry C. 113, 11634-11642 (2009).</li>
<li>Hungerford, G., Allison, A., McLoskey, D., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+Sol-to-Gel+Transitions+via+Fluorescence+Lifetime+Determination+Using+Viscosity+Sensitive+Fluorescent+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Monitoring Sol-to-Gel Transitions via Fluorescence Lifetime Determination Using Viscosity Sensitive Fluorescent Probes.</a> J. Phys. Chem. B. 113, 12067-12074 (2009).</li>
<li>Förster, T., Hoffmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Die+Viskosit%C3%A4tsabh%C3%A4ngigkeit+der+Fluoreszenzquantenausbeuten+einiger+Farbstoffsysteme%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Physikalische+Chemie+Neue+Folge%22%5BJournal%5D)">Die Viskositätsabhängigkeit der Fluoreszenzquantenausbeuten einiger Farbstoffsysteme.</a> Zeitschrift für Physikalische Chemie Neue Folge. 75, 63-76 (1971).</li>
<li>vandeVen, M., Ameloot, M., Valeur, B., Boens, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pitfalls+and+Their+Remedies+in+Time-Resolved+Fluorescence+Spectroscopy+and+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Fluores%22%5BJournal%5D)">Pitfalls and Their Remedies in Time-Resolved Fluorescence Spectroscopy and Microscopy.</a> J. Fluores. 15, 377-413 (2005).</li>
<li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBecker%2C+W+%22Advanced+Time-Correlated+Single+Photon+Counting+Techniques%22">Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Techniques</a>. , Springer. (2005).</li>
<li>O'Connor, D. V., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aO%27Connor%2C+DV+%22Time-correlated+single-photon+counting%22">Time-correlated single-photon counting</a>. , Academic Press. New York. (1984).</li>
<li>Suhling, K., French, P. M. W., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Time-resolved fluorescence microscopy.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 4, 13-22 (2005).</li>
<li>Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J., Carlin, L. M., Keppler, M. D., Ng, T. C., Vojnovic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+time-domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy%3A+practical+application+to+protein-protein+interactions+using+global+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+-+Interface%22%5BJournal%5D)">Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis.</a> Journal of the Royal Society - Interface. 6, S93-S105 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

FLIM oferuje kilka kluczowych zalet w porównaniu z obrazowaniem fluorescencyjnym opartym na intensywności. Pozwala on na raportowanie zdarzeń fotofizycznych, których obserwacja za pomocą obrazowania intensywności fluorescencji jest trudna lub niemożliwa, ponieważ umożliwia ich oddzielenie od efektów stężenia fluoroforu. Jest to szczególnie przydatne przy mapowaniu lepkości wewnątrzkomórkowej poprzez obrazowanie fluorescencyjnych rotorów molekularnych. Czas życia fluorescencji można łatwo przeliczyć na lepkość przy użyciu wykresu kalibracyjnego, jak pokazano na Rys. 3, niezależnie od stężenia fluorescencyjnych rotorów molekularnych.
W metodzie FLIM mogą występować artefakty, które mogą utrudniać interpretację danych.10 Artefakty instrumentalne obejmują światło rozproszone, które przejawia się jako piki na początku zaniku fluorescencji i może zostać pomylone z krótkim czasem zaniku, lub niewielki piki po IRF, który może być spowodowany odbiciami wewnątrz mikroskopu. Artefakty światła rozproszonego można zidentyfikować dzięki dyskryminacji spektralnej – zawsze mają one tę samą długość fali co światło wzbudzenia. Pamiętając, że w powietrzu światło przebywa drogę 30 cm w 1 nanosekundzie, można precyzyjnie określić źródło odbić.
Fluorescencja filtra lub szkła może również powodować artefakt, szczególnie przy niskiej fluorescencji próbki, ale można to łatwo zidentyfikować, wykonując pomiar bez próbki: jeśli w tych okolicznościach zostanie uzyskany zanik, wynika on z działania instrumentu i nie ma związku z próbką! Z drugiej strony należy zauważyć, że autofluorescencja próbki może również przyczyniać się do zaniku fluorescencji.
W metodzie korelacyjnej licznikowej pojedynczych fotonów (TCSPC), nieliniowości przetwornika czas-amplituda (TAC) mogą powodować błędy w dopasowaniu krzywych, jednak można je zidentyfikować poprzez zablokowanie wzbudzenia i naświetlenie próbki światłem otoczenia, np. z transmitowanego źródła światła, a następnie zmierzenie czasu przejścia. W każdym pikselu obrazu powinno zostać uzyskane stałe tło. Obszary, w których występują odchylenia od stałego tła, nigdy nie zapewnią dobrego dopasowania i powinny być pomijane podczas pomiaru, jeśli nie można ich wyeliminować poprzez dostrojenie parametrów karty TCSPC.
Jednym z powszechnie znanych artefaktów w metodzie TCSPC jest zjawisko spiętrzania fotonów (photon pile-up), wywołane zbyt wysoką częstotliwością detekcji fotonów.11,12 Prowadzi to do sytuacji, w której rejestrowany jest czas dotarcia tylko pierwszego fotonu, a kolejne fotony są ignorowane, ponieważ układ elektroniczny jest zajęty pomiarem i przetwarzaniem pierwszego sygnału. Spiętrzanie powoduje skrócenie mierzonego czasu życia fluorescencji; najlepszym sposobem na uniknięcie tego zjawiska jest utrzymanie częstotliwości zliczania fotonów na poziomie około 1% częstotliwości repetycji lasera.
Perspektywy
Istnieje wiele implementacji FLIM i w zależności od zastosowania każda z nich ma swoje zalety i wady.13 Idealny mikroskop fluorescencyjny pozwalałby na pozyskanie w jednym pomiarze całego wielowymiarowego konturu emisji fluorescencji obejmującego intensywność, pozycję, czas życia, długość fali oraz polaryzację, z czułością pojedynczego fotonu, maksymalną rozdzielczością przestrzenną i minimalnym czasem akwizycji. Obecnie nie istnieje technologia o tak unikalnym zestawie cech, a budowa takiego urządzenia pozostaje wyzwaniem dla twórców aparatury. Zastosowanie nowych technik fizycznych do rozwiązywania istotnych problemów w biologii komórki często prowadzi do nieoczekiwanych odkryć, a przed nami jeszcze daleka droga, zanim w pełni wykorzystamy możliwości obrazowania fluorescencyjnego w biologii komórki. Rzeczywiście, obrazowanie parametrów fluorescencji, takich jak czas życia, widmo i polaryzacja, a także szybsze obrazowanie 3D przy wyższej rozdzielczości przestrzennej, z pewnością ujawni nowe aspekty biologii komórki.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&quot;&gt;Próbka z fluorescencyjnymi rotorami molekularnymi&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Sprzęt:&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Prosimy o wprowadzenie treści do przetłumaczenia. Jako profesjonalny tłumacz specjalizujący się w materiałach naukowych i edukacyjnych JoVE, jestem gotowy do przygotowania wiernego, precyzyjnego przekładu na język polski, zgodnie z wytycznymi dotyczącymi rejestru akademickiego i terminologii specjalistycznej.&quot;&gt; odwrócony konfokalny skaningowy mikroskop Leica TCS SP2 &lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. Czekam na treść materiałów JoVE.&quot;&gt;Źródła wzbudzenia: femtosekundowy laser tytanowo-szafirowy Coherent Mira 900 z laserem pompującym Verdi V6 lub pikosekundowy impulsowy laser diodowy Hamamatsu PLP-10 470&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. Prześlij treść z JoVE, a przygotuję wierne, profesjonalne tłumaczenie na język polski, zgodnie z Twoimi wytycznymi dotyczącymi rejestru akademickiego i terminologii naukowej.&quot;&gt;Becker &amp;płyta Hickl SPC 830 w komputerze 3 GHz, Pentium IV, 1 GB RAM z systemem Windows XP&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&quot;&gt;schłodzony zlew Bechera &amp;głowica detektora Hickl PMC100-01 oparta na fotopowielaczach Hamamatsu H5773P-01, zamontowana na mikroskopie&amp;rsquo;port X1 lub detektory hybrydowe&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Proszę dostarczyć tekst źródłowy do tłumaczenia. Jako profesjonalny tłumacz treści naukowych i edukacyjnych JoVE, jestem gotowy do przetłumaczenia materiałów na język polski zgodnie z Twoimi wytycznymi dotyczącymi rejestru akademickiego, precyzji terminologicznej i naturalnego stylu protokołów badawczych.&quot;&gt;moduł sterowania detektorem DCC 100&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Oprogramowanie:&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia. Gdy prześlesz treść, przygotuję profesjonalne tłumaczenie na język polski, zgodnie ze wszystkimi wytycznymi dotyczącymi rejestru naukowego, terminologii i stylu stosowanego w publikacjach JoVE.&quot;&gt; TRI-2&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt; lub SPCImage 2.8 firmy Becker &amp;oraz Hickl&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

obrazowanie czasu życia fluorescencji rotorów molekularnych w żywych komórkach

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Dyfuzja często stanowi istotny etap ograniczający szybkość reakcji chemicznych lub procesów biologicznych i odgrywa rolę w szerokim zakresie zdarzeń wewnątrzkomórkowych. Lepkość jest jednym z kluczowych parametrów wpływających na dyfuzję cząsteczek i białek, a zmiany lepkości wiązano z chorobami i nieprawidłowym funkcjonowaniem na poziomie komórkowym.1-3 Chociaż metody pomiaru lepkości objętościowej są dobrze rozwinięte, obrazowanie mikrolepkości pozostaje wyzwaniem. Mapy lepkości obiektów mikroskopowych, takich jak pojedyncze komórki, do niedawna były trudne do uzyskania. Mapowanie lepkości za pomocą technik fluorescencyjnych jest korzystne, ponieważ – podobnie jak inne techniki optyczne – jest małoinwazyjne, niedestrukcyjne i może być stosowane w żywych komórkach oraz tkankach.
Fluorescencyjne rotory molekularne wykazują czasy życia fluorescencji oraz wydajności kwantowe, które są funkcją lepkości ich mikrośrodowiska.4,5 Wewnątrzmolekularne skręcanie lub rotacja prowadzą do bezpromienistego przejścia ze stanu wzbudzonego z powrotem do stanu podstawowego. Lepkie środowisko spowalnia tę rotację lub skręcanie, ograniczając dostęp do tej ścieżki rozpadu bezpromienistego. Prowadzi to do wzrostu wydajności kwantowej fluorescencji oraz czasu życia fluorescencji. Obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) zmodyfikowanych hydrofobowych barwników BODIPY, które działają jako fluorescencyjne rotory molekularne, wykazuje, że czas życia fluorescencji tych sond jest funkcją mikrolepkości ich otoczenia.6-8 Wykres logarytmiczny czasu życia fluorescencji w funkcji lepkości rozpuszczalnika daje linię prostą zgodną z równaniem Förstera-Hoffmana.9 Wykres ten służy również jako krzywa kalibracyjna do przeliczania czasu życia fluorescencji na lepkość.
Po inkubacji żywych komórek z modyfikowanym fluorescencyjnym rotorem molekularnym BODIPY, na obrazach fluorescencji obserwuje się punktową dystrybucję barwnika. Wartość lepkości uzyskana w punktach w żywych komórkach jest około 100 razy wyższa niż lepkość wody i cytoplazmy komórkowej.6,7 Pomiary anizotropii fluorescencji rozdzielczej w czasie pozwalają wyznaczyć czasy korelacji rotacyjnej zgodne z tymi wysokimi wartościami mikrolepkości. Mapowanie czasu życia fluorescencji jest niezależne od intensywności fluorescencji, co pozwala na oddzielenie efektów stężenia sondy od efektów lepkości.
Podsumowując, opracowaliśmy praktyczne i wszechstronne podejście do mapowania mikrolepkości w komórkach, oparte na technice FLIM fluorescencyjnych rotorów molekularnych.

Obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) stało się kluczową techniką obrazowania środowiska i oddziaływań specyficznych białek oraz barwników w żywych komórkach. FLIM fluorescencyjnych rotorów molekularnych umożliwia mapowanie lepkości w żywych komórkach.

Obrazowanie czasu życia fluorescencji rotorów molekularnych w żywych komórkach

Dyfuzja często stanowi istotny etap limitujący szybkość reakcji chemicznych lub procesów biologicznych i odgrywa rolę w szerokim zakresie procesów wewnątrzkomórkowych...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przeprowadzenie mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) fluorescencyjnych rotorów molekularnych w żywych komórkach. Osiąga się to poprzez uprzednie barwienie komórek zmodyfikowanymi hydrofobowymi barwnikami typu Bodipy, które działają jako rotory molekularne – cząsteczki fluorescencyjne, których czas życia fluorescencji jest funkcją lepkości ich mikrośrodowiska.W drugim kroku przeprowadzono pomiar FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy) w dziedzinie czasu przy użyciu konfokalnego mikroskopu skaningowego. Następnie dane dopasowano do funkcji wykładniczego zaniku, aby wyznaczyć czas życia fluorescencji dla każdego piksela. Następnie można wygenerować mapę FLIM wraz z wykresem histogramu czasu życia fluorescencji, nanosząc czasy życia wyekstrahowane z każdego piksela obrazu FLIM.Histogram czasów życia fluorescencji można uzyskać dla całego obrazu, co pozwala na mapowanie mikrolepkości w odrębnych regionach komórkowych żywych komórek. Mapy lepkości pojedynczych komórek były do niedawna trudne do uzyskania. Mapowanie lepkości za pomocą technik fluorescencyjnych jest korzystne, ponieważ jest małoinwazyjne, niedestrukcyjne, a zatem może być stosowane w odniesieniu do żywych komórek i tkanek.Procedurę zademonstrują mój student doktoratu oraz dr James Levit, stażysta podoktorski w moim laboratorium. Fluorescencja jest sygnałem wieloparametrowym, który można scharakteryzować za pomocą położenia, intensywności, długości fali, czasu życia oraz polaryzacji. W niniejszej procedurze szczególnie interesuje nas położenie i czas życia przed jej rozpoczęciem.Komórki LAR w płytce wielodołkowej lub szalce, którą można ogrzewać do 37 °C i zaopatrywać w 5% carbon dioxide na stole mikroskopu, aż komórki osiągną około 80% konfluencji. Następnie, używając precyzyjnej wagi, odważ odpowiednią ilość barwnika BO dippy C 12 do przygotowania 10 ml roztworu stokowego D o stężeniu około 1 mg/ml; rozpuść D w metanolu za pomocą pipety. Po tym etapie dodaj od 10 do 20 µl roztworu stokowego D do żywych komórek hodowanych w 4 ml pożywki do hodowli komórkowej na dołek.Daje to mikromolowe stężenie barwnika w dołku. Przenieś komórki z powrotem do inkubatora, aby umożliwić barwienie po inkubacji. Przemyj komórki od trzech do czterech razy czterema mililitrami optycznie przejrzystej pożywki do hodowli komórkowej.Pożywka do usunięcia nadmiaru barwnika. Przygotuj się do obrazowania komórek, przenosząc płytkę wielodołkową na stolik mikroskopu podłączonego do kontrolera temperatury i wlotu gazu z 5% carbon dioxide, jeśli jest to wymagane. Przed rozpoczęciem akwizycji filmu z fluorescencyjnych rotorów molekularnych w komórkach, wykonaj obraz w świetle przechodzącym i obraz fluorescencyjny, aby zidentyfikować komórki fluorescencyjne.Należy zweryfikować, czy fluorescencja pochodzi z oczekiwanych lokalizacji wewnątrz komórek. Powinien to być rozkład punktowy z towarzyszącym mu bardziej rozproszonym barwieniem w całej komórce. Należy uzyskać widmo emisji fluorescencji poprzez skanowanie obrazu w różnych zakresach długości fal.Należy zweryfikować, czy widmo odpowiada oczekiwanemu barwnikowi lub białku. Widmo emisji rotora molekularnego zaprezentowanego w tym doświadczeniu powinno gwałtownie rosnąć w okolicy 490 nanometrów, osiągać maksimum w okolicach 515 nanometrów i stopniowo opadać około 600 nanometrów. Jako obraz kontrolny ujemny należy wykorzystać próbkę niebarwioną ST i potwierdzić brak fluorescencji. Następnie należy przełączyć urządzenie w tryb FLIM poprzez przesunięcie lustra z drogi wiązki detekcji fluorescencji.W ścieżce wiązki detekcji fluorescencji należy umieścić odpowiedni filtr emisji fluorescencji, aby zablokować dotarcie światła wzbudzenia do detektora. Po przełączeniu w tryb flimm, należy przygotować się do skanowania próbki. Należy upewnić się, że częstotliwość zliczania detekcji nie przekracza około 1% częstotliwości repetycji lasera.Jeśli tak, należy zmniejszyć intensywność wzbudzenia laserowego, na przykład poprzez umieszczenie filtra neutralnego w torze wiązki lasera. Aby uniknąć zbierania zniekształconych przez efekt spiętrzenia (pileup) krzywych zaniku fluorescencji, należy pozyskać obraz typu slim zazwyczaj przez trzy do pięciu minut, a następnie przerwać skanowanie i zapisać surowe dane. Surowe dane stanowią trójwymiarową kostkę danych składającą się z współrzędnych przestrzennych X i y oraz czasu; należy otworzyć surowe dane w pakiecie oprogramowania do analizy zaniku fluorescencji.Przedstawiono tutaj obraz SPC wykonany przez Beckera i Hickle. Wyświetla on obraz natężenia fluorescencji, który stanowi zintegrowany zanik fluorescencji. W każdym pikselu należy wybrać typowy piksel, umieszczając na nim kursor.Przeanalizuj zanik fluorescencji w tym pikselu. Jeśli liczba zliczeń w szczycie jest mniejsza niż 100, zastosuj przestrzenne sumowanie pikseli, dodając zliczenia z pikseli sąsiednich do piksela centralnego, aby uzyskać wyższą liczbę zliczeń w szczycie. Zapewni to większą dokładność statystyczną w kolejnym kroku.Następnie należy wybrać globalną wartość progu pikseli i zastosować dopasowanie do pojedynczej funkcji wykładniczego zaniku dla obrazu. Wynikiem jest czas życia fluorescencji dla każdego piksela powyżej progu. Korzystając z tęczowej skali kolorów, oprogramowanie przypisuje kolor do każdego piksela.Następnie każdy piksel jest kolorowany zgodnie z wynikiem dopasowania i z obrazu FLIM otrzymywana jest mapa, a następnie wykreśla się częstotliwość występowania określonych czasów życia fluorescencji w funkcji samego czasu życia fluorescencji, aby uzyskać histogram czasu życia fluorescencji. Wykres ten powinien mieć kształt krzywej dzwonowej, a jego wartość średnia powinna być zgodna z innymi badaniami Bo JPC 12 w komórkach; należy dostosować zakres kolorów w taki sposób, aby rozkład czasu życia fluorescencji mieścił się w zakresie kolorów przypisanym do przedziału czasów życia. W poszczególnych pikselach należy sprawdzić zredukowane wartości chi-kwadrat.Wartość wynosząca w przybliżeniu od 1 do 1,3 wskazuje na dobry dopasowanie; należy wówczas sprawdzić odpowiadające mu reszty, które powinny być rozłożone losowo wokół zera. Jeśli dopasowanie monoeksponencjalne nie daje korzystnej wartości chi-kwadrat i występuje systematyczne odchylenie reszt od zera, wymagany jest bardziej zaawansowany model. Korzystając z odpowiedniego pakietu oprogramowania, należy dopasować dane do podwójnego zaniku eksponencjalnego, aby uwzględnić dwa różne środowiska sondy.Dopasowanie pozwoli również wyznaczyć przedwykładnicze czynniki wykładnicze lub amplitudy, które dają wskazówkę co do względnej ilości diety w jednym środowisku w stosunku do innego. Wyniki dla czasów życia fluorescencji i przedwykładniczych czynników wykładniczych mogą być następnie zakodowane kolorystycznie, ponieważ każdy piksel jest kolorowany zgodnie z jego wartością i zestawiany z innymi. Aby uzyskać stosunek czasów życia oraz stosunek przedwykładniczych czynników wykładniczych dla każdego piksela, należy sprawdzić, czy zredukowane wartości chi-kwadrat wskazują na prawidłowe dopasowanie.Należy sprawdzić reszty, które ponownie powinny być rozłożone losowo wokół zera; histogram rozkładu czasu życia fluorescencji powinien towarzyszyć wszystkim obrazom w celu łatwej wizualizacji średnich wartości czasu życia fluorescencji oraz rozkładu czasu życia fluorescencji. Przedstawiono zaniki fluorescencji zmierzone dla rotora molekularnego przy zwiększającej się lepkości w mieszaninach metanolu i glicerolu. Zaniki fluorescencji są monoeksponencjalne, a czas życia fluorescencji zmienia się znacząco w funkcji lepkości.Wartość ta wzrasta od około 300 ps w metanolu do 3,4 ns w 95% glicerolu. Logarytmiczny wykres kalibracyjny logarytmu czasu życia fluorescencji w funkcji logarytmu lepkości. Dla BO DPC 12 daje to linię prostą zgodnie z wymuszonym równaniem Hoffmana.Intensywność fluorescencji naszych komórek inkubowanych z rotorem molekularnym wyraźnie wykazuje wewnątrzkomórkowe pobranie rotora molekularnego z punktową dystrybucją. Prawdopodobnie w kropelkach lipidowych. Przedstawiono obraz komórek LAR inkubowanych z Bo DPC 12.Jasne obszary punktowe wykazują krótszy czas życia niż obszary cytoplazmatyczne, co zgodnie z równaniem Förstera-Hoffmana odpowiada niższej lepkości. Zanik fluorescencji w każdym pikselu obrazu można w sposób odpowiedni dopasować za pomocą modelu pojedynczego zaniku wykładniczego. Poprzez wykreślenie czasów życia wyodrębnionych z każdego piksela można uzyskać histogram czasów życia fluorescencji dla całego obrazu.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak mapować lepkość w żywych komórkach przy użyciu fluorescencyjnych rotorów molekularnych.

fluorescence-lifetime-imaging-of-molecular-rotors-in-living-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Badanie fluorescencji czasu życia wirujących cząsteczek molekularnych w żywych komórkach

Niniejszy protokół opisuje metodę trójwymiarowego obrazowania stężenia tlenu w skali mikronowej w bezpośrednim otoczeniu żywych komórek z wykorzystaniem mikroskopii rezonansu spinowego elektronów.

Mikroobrazowanie za pomocą rezonansu spin-elektronowego żywych organizmów do mapowania tlenu

Mikrofluidyczne platformy kropelkowe są obiecującymi narzędziami do eksperymentów wysokoprzepustowych, ponieważ umożliwiają one niskokosztowe generowanie piko-litrowych, samoczynnie odseparowanych komór z częstotliwością rzędu kHz. Dzięki integracji z szybkimi, czułymi i wysokorozdzielczymi metodami spektroskopii fluorescencyjnej, duże ilości informacji generowanych w tych systemach mogą być efektywnie wydobywane, przetwarzane i wykorzystywane.

Metody detekcji fluorescencyjnej dla mikroprzepływowych platform kroplkowych

Źródło: Pigazzini, M. L., et. al. Charakterystyka struktur amyloidowych w starzeniu się C. Elegans Korzystanie z obrazowania czasu życia fluorescencji. J. Vis. exp. (2020). Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) do oceny agregacji białek polyQ w neuronach C. elegans, porównując robaki kontrolne i robaki z niedoborem białka opiekuńczego. Zwiększona agregacja u robaków z niedoborem białka opiekuńczego sprzyja przenoszeniu energii między...

Obrazowanie czasu życia fluorescencji agregacji białka PolyQ w neuronach Caenorhabditis elegans

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Ten protokół opisuje nową metodę pozwalającą na ilościową wizualizację złożonego tworzenia białek SNARE, opartą na transferze energii rezonansu Förstera i mikroskopii obrazowania życia fluorescencji.

Wizualizacja wewnątrzkomórkowego transportu SNARE za pomocą mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Przedstawiono procedurę wizualizacji aktywności kinazy białkowej A u myszy zachowujących się jak myszy. Ulepszony reporter aktywności kinazy A, tAKARα, ulega ekspresji w neuronach korowych i jest dostępny do obrazowania przez okno czaszkowe. Mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej służy do wizualizacji aktywności PKA in vivo podczas wymuszonej lokomocji.

Wizualizacja aktywności kinazy białkowej A u myszy zachowujących się z głową przy użyciu mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej in vivo

Aktywacja wielofunkcyjnej kinazy Ser/Thr AURKA jest charakterystyczna dla jej autofosforylacji na Thr288. Sondy fluorescencyjne polegające na FRET mogą rozróżniać między jego stanem nieaktywnym i aktywowanym. Tutaj ilustrujemy niektóre strategie inżynierii sondy, wraz z szybkim protokołem FRET, aby śledzić aktywację kinazy przez cały czas trwania mitozy.

Monitorowanie w czasie rzeczywistym aktywacji kinazy A zorzy polarnej za pomocą konformacyjnych biosensorów FRET w żywych komórkach

Ten protokół opisuje obrazowanie fluorescencyjne i analizę endogennych koenzymów metabolicznych, zredukowanego dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (fosforanu) (NAD(P)H) i utlenionego dinukleotydu flawinoadeninowego (FAD). Obrazowanie autofluorescencyjne NAD(P)H i FAD zapewnia bezznacznikową, nieniszczącą metodę oceny metabolizmu komórkowego.

Obrazowanie autofluorescencyjne w celu oceny metabolizmu komórkowego

Ten artykuł opisuje użycie nowego, szybkiego imagera optycznego do makroskopowego obrazowania czasu życia fotoluminescencji próbek emitujących długie rozpady. Opisano procedury integracji, akwizycji i analizy obrazu, a także przygotowanie i charakterystykę materiałów sensorów do obrazowania oraz zastosowania imagera w badaniu próbek biologicznych.

Termoobrazownik o żywotności fluorescencji do zastosowań biomedycznych

Celem tego protokołu jest umożliwienie ilościowego pomiaru czasu życia fluorescencji sond Riboglow dla powtarzalnych przepływów pracy obrazowania RNA in vitro, w żywych komórkach ssaków i w trójwymiarowym modelu komórkowym. Przedstawiamy przykłady przygotowania próbek, dostarczania sond, pozyskiwania danych oraz przepływów pracy analizy ilościowej w celu pozyskania bezstronnego pomiaru czasu życia fluorescencji.

Charakteryzacja sond Riboglow in vitro jako podstawa dla fluorescencyjnego obrazowania czasu życia w żywych komórkach ssaków i trójwymiarowych modelach komórkowych

Poznaj technikę FLIM do mapowania lepkości w żywych komórkach za pomocą fluorescencyjnych wirników molekularnych. Ta metoda pozwala wizualizować mikrośrodowiska komórkowe w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie czasu życia fluorescencji rotorów molekularnych w żywych komórkach

Przeglądaj więcej filmów