Obrazowanie wielofotonowe inwazji komórek nowotworowych w ortotopowym modelu mysim dla raka płaskonabłonkowego jamy ustnej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie mysiego modelu raka jamy ustnej, który umożliwia wizualizację i kwantyfikację naciekania nowotworu w języku. Osiąga się to poprzez wstępne wygenerowanie komórek raka płaskonabłonkowego jamy ustnej do obrazowania dwufotonowego za pomocą infekcji lentiwirusowej Life Act M cherry oraz stabilnej selekcji klonalnej. Następnie tworzy się ortotopowe ksenoprzeszczepy nowotworowe u myszy nago poprzez wstrzyknięcie komórek znakowanych Life Act M cherry do języków znieczulonych myszy.

Następnie języki zawierające guzy poddawane są obrazowaniu za pomocą mikroskopii dwufotonowej. W rezultacie możliwe jest uzyskanie wyników wykazujących ilościową ocenę miejscowej inwazji guza jamy ustnej w mięsień języka poprzez obrazowanie dwufotonowe świeżej tkanki języka i późniejszą komputerową rekonstrukcję trójwymiarową guzów pierwotnych oraz regionalnie naciekających grup komórkowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak immunohistochemia czy obrazowanie bioluminescencyjne, jest możliwość ilościowego pomiaru inwazji komórek nowotworowych w trzech wymiarach.

Wnioski płynące z zastosowania tej techniki mają znaczenie dla interwencji terapeutycznych w raku jamy ustnej, ponieważ dostarcza ona modelu systemowego do analizy białek zaangażowanych w inwazję nowotworową, a także do oceny związków przedklinicznych w strategiach terapeutycznych przeciwinwazyjnych. Zazwyczaj osoby początkujące w tej technice mogą napotykać trudności, gdyż wstrzykiwanie komórek nowotworowych do języka oraz przygotowanie języka do mikroskopii dwufotonowej są technicznie wymagające i wymagają wprawy oraz praktyki. Wizualizacja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy wstrzykiwania guza i obrazowania dwufotonowego są trudne do opanowania i wymagają specjalistycznych umiejętności. Aby rozpocząć hodowlę.

Linie komórkowe nowotworów głowy i szyi człowieka w pożywce kompletnej składającej się z DMEM uzupełnionego o 10% FBS, 1% penicyliny-streptomycyny oraz 1% nieessentialnych aminokwasów. W celu przeniesienia sekwencji kodującej LIFE Act mCherry do wektora lentiwirulowego pLKO.1, w pierwszej kolejności wymagana jest mutogeneza celowana w celu wprowadzenia trzech mutacji synonimicznych do miejsca rozpoznawania SbfI w macierzystym cDNA mCherry. Następnie sekwencję zmodyfikowanego LIFE Act mCherry z flankującymi miejscami EcoRI i SbfI namnożono metodą PCR i subklonowano do pLKO.1. Aby wygenerować konstrukt pLKO.1 LIFE Act mCherry przy użyciu lentiwirulowego systemu ekspresyjnego, linię komórek opakowujących 293T hodowano w pożywce kompletnej do osiągnięcia 17–40% konfluencji.

Za pomocą CalFOSS przeprowadź transfekcję komórek wektorami PLL 7.0 LIFE Act M cherry PS PACS 2 oraz P-VSV-G w stosunku odpowiednio 3:2:1. Po 24 godzinach wymień pożywkę na świeżą pożywkę kompletną, a następnie zbieraj i uzupełniaj pożywkę co 12 godzin przez okres 72 godzin, przechowując zebraną pożywkę w temperaturze 4 °C w celu wytworzenia linii komórkowych głowy i szyi ze stabilną ekspresją LIFE Act M cherry. Wirował zebraną pożywkę z prędkością 2000 RPM przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie dodaj 1 mL sklarowanej pożywki zawierającej wirusa do komórek OSC 19 lub USCCC1 na 12 godzin.

Przepłucz komórki, a następnie dodaj kolejny jeden mililitr wirusa na kolejne 12 godzin. Hoduj komórki w medium zawierającym 200 mg/mL puromycyny przez dwa tygodnie. Aby wyselekcjonować kolonie oporne, dokonaj wizualnej oceny przeżyłych kolonii pod kątem ekspresji mCherry przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Trypsynizuj poszczególne pozytywne kolonie, używając sterylnych dysków klonujących o średnicy 3 mm.

Utrzymywać komórki pozytywne w medium zawierającym 200 mg/ml puromycyny aż do zamrożenia lub wykorzystania do wstrzyknięcia ortotopowego w celu wytworzenia ortotopowego ksenoprzeszczepu nowotworowego. Przenieść komórki nowotworowe wykazujące ekspresję mCherry z użyciem trypsyny, następnie odwirować kulturę i resuspendować około 2,5 × 10⁴ komórek w 50 µL pełnego medium. Przenieść komórki nowotworowe do strzykawki o pojemności 1 mL z założoną igłą 27G o długości pół cala.

Następnie znieczul ośmiotygodniową samicę myszy athymicznej (myszy naga) za pomocą kombinacji 80 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny. Gdy zwierzę przestanie się poruszać, nałóż maść nawilżającą do oczu i sprawdź reaktywność, uciskając paznokciem opuszkę stopy.

Utrzymuj myszy na podgrzewanej podkładce w temperaturze od 37 do 40 °C. Za pomocą sterylnej pęsety delikatnie chwyć czubek języka i wyciągnij go z jamy ustnej. Powoli wstrzyknij komórki w jedną stronę każdego języka, aby utworzyć grudkowatą masę w centrum języka.

Wstrzyknąć myszom 2,1 mg/kg johimbiny i umieścić je ponownie na podkładce grzewczej, aby monitorować je podczas wybudzania z narkozy. Umieścić myszy w sterylnych klatkach zawierających miękką dietę transgeniczną. Ważyć myszy co dwa do trzech dni i monitorować je wizualnie pod kątem pojawienia się guza.

Aby przygotować języki myszy do obrazowania ex vivo, przeprowadź eutanazję myszy z nowotworami w różnych punktach czasowych. Po uśpieniu zwierząt metodą inhalacji dwutlenkiem węgla, wyciąć języki i przepłukać je roztworem XPBS. Następnie użyć monofilamentowej nici krawieckiej z lokalnego sklepu z artykułami hobbystycznymi oraz igły krawieckiej rozmiaru 8.

Przymocuj język do jednej strony konwencjonalnej kasety do zatapiania tkanek w parafinie. Po unieruchomieniu języka zanurz cały zespół kasety w roztworze XPBS. Natychmiast poddaj języki badaniu z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej w celu wykonania obrazowania.

Zanurz kasety z językiem w 60 milimetrowym naczyniu zawierającym 1XPBS. Zabezpiecz naczynie w uchwycie o specjalnej konstrukcji na wysuwanym ramieniu wspornikowym umieszczonym pod obiektywem mikroskopu dwufotonowego. Umieść obiektyw zanurzeniowy z wodą o powiększeniu 40 x i aperturą numeryczną 0,8 bezpośrednio na widocznej zmianie nowotworowej lub nad nią.

Wykonaj obrazowanie języka za pomocą mikroskopii dwufotonowej z wykorzystaniem tytanowego lasera szafirowego o intensywności 60 mW i długości fali wejściowej 755 nm. Aby zoptymalizować sygnał mCherry, wykonaj seryjne obrazy skanowania laserowego co 1 µm na głębokościach przyrostowych 1 µm, obejmując całkowitą głębokość tkanki od 15 do 100 µm. Przy tej konfiguracji można analizować guzy o głębokości w tkance do 1 mm.

Do przechwytywania obrazów należy użyć funkcji scan image. Funkcja scan image generuje dwukanałowy wyjściowy sygnał wzorców skanowania rastrowego do sterowania galwanometrycznymi lustrami skanującymi XY, a jednocześnie przechwytuje do czterech kanałów sygnałów wejściowych z fotopowielaczy za pomocą karty akwizycji danych. Scan image umożliwia zbieranie obrazów w stosie Z (Z stack) poprzez sterowanie osią Z obiektywu oraz rejestrowanie obrazów time-lapse w trybie pojedynczym lub cyklicznym.

Zapisz obrazy w jednym pliku TIF z głębią bitową 16 bit. Używając oprogramowania Amira, wyrenderuj stosy obrazów guza w jeden obraz trójwymiarowy poprzez otwarcie pliku TIF zawierającego zestaw obrazów z serii Z. Użyj funkcji TEX, aby wygenerować rendering trójwymiarowy.

Na przetworzonym obrazie prawdopodobnie pojawi się obraz dużego guza pierwotnego wraz z kilkoma mniejszymi, oddzielonymi grupami inwazyjnymi (ig). Aby zmierzyć objętość guza, należy zdefiniować próg dla obszaru guza pierwotnego oraz dla każdego przekroju stosu obrazów, korygując i eliminując fluorescencję tła. Powtórz procedurę progowania dla każdej grupy inwazyjnej.

Po wybraniu guza pierwotnego oraz wszystkich grup inwazyjnych (igs), określ pomiar objętości oraz współrzędne OID guza w osiach X, Y i Z dla guza pierwotnego. Aby obliczyć odległości grup inwazyjnych od centralnego punktu guza, oblicz indeks inwazyjności guza (ti) korzystając ze wzoru: ti równa się NT razy VT razy dt. Gdzie NT oznacza całkowitą liczbę grup inwazyjnych na obrazie, VT oznacza całkowitą objętość wszystkich grup inwazyjnych, a DT oznacza całkowitą odległość przebytą przez wszystkie grupy inwazyjne od centrum guza pierwotnego.

Trójwymiarowe renderingi z większą szczegółowością topograficzną można wygenerować poprzez import oryginalnych 16-bitowych monochromatycznych plików końcówki do programu Nikon NIS elements. Utwórz plik ND ze stosu obrazów. Następnie ręcznie skalibruj dokument, aby określić rozmiar piksela w celu uzyskania renderingów o wyższej jakości.

Dodaj dodatkowe przekroje w płaszczyźnie Z. Na tym rysunku przedstawiono przykład surowych danych pozyskanych z obrazowania dwufotonowego za pomocą oprogramowania NIS Elements lub lustra. Do rekonstrukcji surowych danych guzów języka, zaprezentowanych na tym rysunku, można wykorzystać oprogramowanie.

Ten panel przedstawia przykład renderowania trójwymiarowego z wykorzystaniem funkcji TEX w oprogramowaniu Amira. Poniżej znajduje się przykład progowania pojedynczego przekroju dwufotonowego ze stosu obrazów w celu zidentyfikowania grup naciekających z guza pierwotnego, a także centrum guza pierwotnego (oid). Po przeanalizowaniu każdego przekroju poddanego progowaniu, program Amira określa objętość oraz dystans przebyty przez każdą grupę naciekającą od centrum.

Dane te można przedstawić graficznie i wykorzystać do uzyskania wartości liczbowej całkowitego stopnia naciekania komórek nowotworowych. Przedstawione tutaj obrazy reprezentatywne dla miejsca pierwotnego ukazują guzy zwizualizowane za pomocą konwencjonalnego patologicznego znakowania immunohistochemicznego w porównaniu z obrazem trójwymiarowym podobnego guza uzyskanym zgodnie z opisanym protokołem. Po opanowaniu techniki, od momentu wycięcia języka do końcowego renderowania 3D, procedura ta może zostać przeprowadzona w około dwie godziny, jeśli jest wykonana prawidłowo. Podczas realizacji tej procedury należy uważać, aby nie przebić igłą języka na wylot, co mogłoby doprowadzić do utraty komórek nowotworowych i utrudnić pobranie guza. Po wykonaniu tej procedury można przeprowadzić testy związków terapeutycznych lub komórek z manipulowanym poziomem białek w celu określenia ich skuteczności w hamowaniu naciekania raka jamy ustnej.

W warunkach in vivo należy pamiętać, że praca z ludzkimi komórkami nowotworowymi zmodyfikowanymi za pomocą lentiwirusa jest niebezpieczna; podczas pracy z myszami po iniekcji należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie odpowiednich środków ochrony indywidualnej i praca w certyfikowanym dygestorium z laminarnym przepływem powietrza poziomu BSL 2.