Name: Obrazowanie wielofotonowe inwazji komórek nowotworowych w ortotopowym mysim modelu raka płaskonabłonkowego jamy ustnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Poznaj metodę obrazowania wielofotonowego inwazji komórek nowotworowych w ortotopowym mysim modelu raka jamy ustnej. Technika umożliwia trójwymiarową wizualizację i ilościową ocenę terapii przeciwzapalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca wspierana przez podprojekt grantu NIH P20 RR16440 oraz grant pomostowy przyznany S. Weed przez Biuro Badań i Edukacji Podyplomowej Uniwersytetu West Virginia. Z wdzięcznością dziękujemy za pomoc techniczną L. Lopez-Skinner w początkowych fazach rozwoju projektu. Autorzy są również wdzięczni za pomoc techniczną i komórki OSC19 otrzymane od J. Myers i M. Younes (Department of Head and Neck Surgery, M.D. Anderson Cancer Center, Houston, TX); P. Turner i K. Secrest (West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank) za obróbkę i procedury histologiczne, R. Wysolmerski (West Virginia University, Department of Neurobiology and Anatomy) za konstrukt LifeAct-mCherry oraz J. Bear (University of North Carolina) za lentiwirusem wektor pLL7.0. Z wdzięcznością dziękujemy również za możliwość korzystania z West Virginia University Microscopy Imaging Facility (wspieranej przez grant NIH P20 RR16440 oraz Mary Babb Randolph Cancer Center) oraz tamtejszego laboratorium nieliniowej mikroskopii optycznej (NLOM; wspieranego przez wspólną współpracę pomiędzy West Virginia University Center for Neuroscience a West Virginia University Department of Physics/West Virginia Nanoscience Initiative). Laboratorium NLOM jest częściowo finansowane z grantu NIH P30 RR031155 przyznanego Center for Neuroscience.

1. Linie komórkowe, konstrukcja wektora i produkcja lentiwirusów
<ol>
	<li>Ludzkie linie komórkowe nowotworów głowy i szyi (OSC19 lub UMSCC1) hodowano w pożywce kompletnej składającej się z DMEM (Cellgro kat. nr 50-003-PB) uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej FBS (Hyclone kat. nr SH30070.03), 1% penicyliny/streptomycyny (Cellgro kat. nr 30-002-CI) oraz 1% nieessentialnych aminokwasów (Cellgro kat. nr 25-025-CI).</li>
	<li>Aby przenieść sekwencję kodującą LifeAct-mCherry do lentiwirusego wektora pLL7.0, zmodyfikowano miejsce rozpoznawania Sbf1 w macierzystym cDNA mCherry poprzez wprowadzenie trzech mutacji cichych do sekwencji rozpoznawczej przy użyciu mutagenezy celowanej (Stratagene kat. nr 200518-5). Otrzymaną zmodyfikowaną sekwencję LifeAct-mCherry namnożono metodą PCR z flankującymi miejscami EcoR1/Sbf1, a następnie subklonowano do pLL7.0 w celu wygenerowania konstruktu pLL7.0-LifeAct-mCherry.</li>
</ol>
2. Produkcja wirusa pLL7.0-LifeAct-mCherry
<ol>
	<li>Produkcję wirusową przeprowadzono zgodnie z instrukcją Lentiviral Expression Systems (System Bioscience wersja 2-051018).</li>
	<li>Linia komórek opakowujących 293T/17 (ATCC kat. # CRL-11268) była hodowana do 40% konfluencji w tym samym pełnym medium, którego używano dla linii HNSCC.</li>
	<li>Komórki transfekowano wektorami pLL7.0-LifeAct-mCherry, psPAX2 oraz pVSV-G w stosunku odpowiednio 3:2:1, wykorzystując CalPhos (Clontech kat. # 631312).</li>
	<li>Po 24 godzinach początkowe medium z transfekcji wymieniono na świeże medium.</li>
	<li>Następnie medium zbierano i uzupełniano co 12 godzin przez okres 72 godzin, przechowując je w temperaturze 4°C.</li>
</ol>
3. Wytwarzanie linii komórkowych głowy i szyi ze stabilną ekspresją LifeAct-mCherry
<ol>
	<li>Zebraną pożywkę wirowano z prędkością 2000 rpm przez 10 minut w temperaturze 4°C.</li>
	<li>1 mL oczyszczonej pożywki zawierającej wirusa dodano bezpośrednio do komórek OSC19 lub UMSCC1 na 12 godzin. Następnie komórki przepłukano i dodano kolejny 1 mL wirusa na kolejne 12 godzin.</li>
	<li>Komórki traktowano pożywką zawierającą 200mg/ml puromycyny przez dwa tygodnie w celu wyselekcjonowania kolonii opornych.</li>
	<li>Przeżyłe klony przesiewano wizualnie pod kątem ekspresji LifeAct-mCherry za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Pojedyncze dodatnie kolonie poddano trypsynizacji przy użyciu sterylnych 3mm dysków do klonowania (Fisher kat # 0790710A).</li>
	<li>Dodatnie komórki hodowano w pożywce zawierającej 200mg/ml puromycyny do momentu ich zamrożenia lub wykorzystania do wstrzyknięć ortotopowych.</li>
</ol>
4. Tworzenie ortotopowego ksenoprzeszczepu guza
<ol>
	<li>Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem (09-0821) zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu West Virginia.</li>
	<li>Komórki nowotworowe wykazujące ekspresję LifeAct-mCherry poddano trypsynizacji oraz wirowaniu, a następnie 2,5 x 104 komórek zawieszono w 50 μL pożywki kompletnej.</li>
	<li>Komórki nowotworowe wprowadzono do strzykawki o objętości 1 ml z przymocowaną igłą o rozmiarze 27 ½ G.</li>
	<li>Samice myszy atymicznych Fox1nu/nu w wieku 8 tygodni (Harlan Laboratories) zanestezjowano kombinacją 80 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny. Zanestezjowane myszy utrzymywano w temperaturze 37-40 °C na podkładce grzewczej.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pincety delikatnie chwycono czubek języka i ostrożnie wysunięto go z jamy ustnej.</li>
	<li>Komórki powoli wstrzykiwano w jedną stronę każdego języka, aby utworzyć guzowatą masę w centrum języka, unikając naczyń tętnic językowych.</li>
	<li>Myszom wstrzyknięto 2,1 mg/kg johimbiny i przeniesiono je z powrotem na podkładkę grzewczą, gdzie monitorowano je przez 2-3 godziny podczas wybudzania z narkozy.</li>
	<li>Po odzyskaniu przytomności myszy umieszczono w sterylnych klatkach zawierających miękką dietę z ciasta transgenicznego (Bioserve kat. nr S3472).</li>
	<li>Myszy ważono co 2-3 dni i monitorowano wizualnie pod kątem pojawienia się guza.</li>
</ol>
5. Przygotowanie języków myszy do obrazowania ex-vivo
<ol>
	<li>Myszy z guzami w różnych punktach czasowych (zazwyczaj 2-4 tygodnie po wstrzyknięciu) uśmiercono poprzez inhalację dwutlenkiem węgla.</li>
	<li>Wycięto języki, przepłukano je 1X PBS i przymocowano do jednej strony standardowej kasety do zatapiania tkanek w parafinie (StatLab Cat #H104,) za pomocą monofilamentowej nici krawieckiej z lokalnego sklepu hobbystycznego oraz igły krawieckiej rozmiaru 8.</li>
	<li>Po unieruchomieniu języków cały zespół kasety umieszczono w 30mm naczyniu do hodowli tkankowej i zanurzono w 1X PBS.</li>
	<li>Przetworzone języki niezwłocznie wykorzystano do mikroskopii dwufotonowej.</li>
</ol>
6. Obrazowanie nowotworów języka za pomocą mikroskopii dwufotonowej
<ol>
	<li>Kasety z językami zanurzono w szalce 60 mm zawierającej 1X PBS, przymocowanej w specjalnie zaprojektowanym uchwycie na wysuwanym ramieniu wspornikowym (Chamber Shuttle, Siskiyou instruments) umieszczonym pod obiektywem mikroskopu pionowego (Moveable Microscope (MOM); Sutter Instruments).</li>
	<li>Obiektyw imersyjny wodny 40X/0.8NA umieszczono bezpośrednio na widocznych zmianach nowotworowych lub nad nimi. Obrazowanie języków przeprowadzono za pomocą mikroskopii dwufotonowej z laserem Ti:szafir (Mira, Coherent) przy intensywności 60 mW i długości fali wejściowej 755 nm w celu optymalizacji sygnału mCherry.</li>
	<li>Seryjne obrazy z laserowego skanowania o szerokości 1 mm gromadzono w odstępach głębokości 1 μm na całkowitej głębokości tkanki od 15 do 100 μm (w zależności od objętości guza). Obrazy rejestrowano za pomocą ScanImage, programu open source opartego na platformie MATLAB, opracowanego w laboratorium Karela Svobody (Janelia Farms, HHMI). ScanImage generuje dwukanałowy sygnał wyjściowy wzorów skanowania rastrowego do sterowania galwanometrycznymi lustrami skanującymi x/y, a jednocześnie rejestruje maksymalnie czterokanałowy sygnał wejściowy z lamp fotopowielaczy (PMTs) za pośrednictwem karty akwizycji danych (PCI-6610S, National Instruments). Sygnały z PMT są wzmacniane przez nisko szumowe przedwzmacniacze prądowe (SR570, Stanford Research System) przed przesłaniem do karty NI-DAQ w celu wyświetlenia na monitorze. ScanImage zbiera obrazy z serii z-stack poprzez sterowanie osią z obiektywu oraz rejestruje obrazy time-lapse w trybie pojedynczym lub cyklicznym. Obrazy zapisywano w pojedynczym pliku TIFF z głębią 16 bitów.</li>
</ol>
7. Analiza obrazów przy użyciu oprogramowania Amira
<ol>
	<li>Obrazowanie w programie Amira w celu kwantyfikacji guza: w oprogramowaniu Amira otwórz plik TIFF zawierający zestaw obrazów z serii z-stack.</li>
	<li>Zaznacz nazwę pliku, a następnie wybierz i zastosuj funkcję Voltex, aby wygenerować renderowanie trójwymiarowe. Na wyrenderowanym obrazie zazwyczaj widoczny jest duży obraz guza pierwotnego wraz z kilkoma mniejszymi, rozproszonymi grupami inwazyjnymi (IG) składającymi się z komórek naciekających (patrz Rysunek 6A).</li>
	<li>Aby zaznaczyć masę guza pierwotnego, wybierz „Open Data”, następnie „Labeling”, a potem „Label Field”.</li>
	<li>Progowanie guza pierwotnego – zaznacz wszystkie obrazy z serii z-stack i przewiń obrazy w płaszczyźnie z, aby upewnić się, że w trzech wymiarach uwzględniona jest tylko masa guza pierwotnego. Jest to zazwyczaj największy obraz w polu widzenia, który często wydaje się podzielony podczas przesuwania przez płaszczyznę z.</li>
	<li>Użyj funkcji magicznej różdżki/progowania, aby skorygować fluorescencję tła i usunąć ją z obrazu bez odrzucania sygnału z guza. Zaznacz etykietę „Inside File” i kliknij przycisk ⊕. Zaznacz pole wyboru „All Slices”. Spowoduje to utworzenie kolorowej obramowania wokół progowanego obszaru guza pierwotnego w każdym przyroście serii z-stack.</li>
	<li>Aby zaznaczyć IG, wybierz funkcję „New”. Zaznacz pojedynczą IG i upewnij się, przewijając płaszczyznę z, że nie jest ona powiązana z guzem pierwotnym.</li>
	<li>Zaznacz „All Slices” i kliknij przycisk ⊕. Zmień nazwę pliku (np. IG 1).</li>
	<li>Powtórz procedurę progowania opisaną w punkcie 7.4 oraz krok zaznaczania z punktu 7.5 dla wyznaczonej IG. Wybierz kolor obrysu inny niż kolor użyty do oznaczenia masy guza pierwotnego.</li>
	<li>Powtarzaj czynność w razie potrzeby dla każdej kolejnej IG na całym obrazie, skanując płaszczyznę z, aby upewnić się, że wszystkie IG zostały oznaczone. Użycie różnych kolorów dla każdej zidentyfikowanej IG ułatwia późniejszą identyfikację na obrazie.</li>
	<li>Po zaznaczeniu guza pierwotnego i wszystkich IG wybierz „Segmentation” z menu rozwijanego, a następnie „Material Statistics”. Pozwala to na uzyskanie pomiaru objętości oraz współrzędnych X, Y i Z rdzenia guza pierwotnego w celu obliczenia odległości IG od centralnego punktu guza.</li>
	<li>Po obliczeniu objętości wyznacz odległość każdej IG od centralnego rdzenia guza pierwotnego. Wybierz „Segmentation”, a następnie „Material Statistics”. Krok ten oblicza wszystkie pomiary w pikselach. Przelicz piksele na mikrometry na podstawie kalibracji obiektywu mikroskopu i wszelkich dodatkowych zwiększeń powiększenia (np. funkcji zoom). Dla mikroskopu i ustawień użytych w tych eksperymentach zastosowano obiektyw 40X bez zoomu, co dało kalibrację 1 pixel = 0.298 μm. Zaimportuj dane do arkusza Excel, który zawiera parametry guza pierwotnego w trzech wymiarach (X1, Y1, Z1) oraz dla każdej IG (np. X2, Y2, Z2 dla pierwszej IG).</li>
	<li>Odległość inwazyjną w mikronach dla każdej IG od centrum guza pierwotnego oblicza się za pomocą wzoru √((X2-X1)2 + (Y2-Y1)2 + (Z2-Z1)2).</li>
	<li>Indeks inwazyjności guza (TI) oblicza się za pomocą wzoru TI = NT x VT x DT, gdzie NT = całkowita liczba IG na obrazie, VT = całkowita objętość wszystkich IG, DT = całkowita odległość przebyta przez wszystkie grupy inwazyjne od centrum guza pierwotnego.</li>
</ol>
8. Renderowanie trójwymiarowe przy użyciu oprogramowania Nikon NIS-Elements
<ol>
	<li>Trójwymiarowe renderingi o większej szczegółowości topograficznej można wygenerować poprzez zaimportowanie oryginalnych 16-bitowych monochromatycznych plików TIFF całego obrazu guza do pakietu oprogramowania Nikon NIS-Elements (Nikon, Melville, NY). Wybierz „File”, następnie „ND”, a potem „Create ND File from File Sequence”. Wybierz stos obrazów z-series TIFF i określ odpowiednią wielkość kroku.</li>
	<li>Kalibruj dokument ND w płaszczyźnie xy. Określ rozmiar jednego piksela, korzystając z kalibracji ręcznej.</li>
	<li>Wybierz „Volume View”. Użyj funkcji „HQ”, aby obliczyć dodatkowe przekroje w płaszczyźnie z w celu uzyskania wyższej jakości. W „3D Renderer Settings” użyj „Advanced Renderer” z jakością „Ultra High Details” i „Full Resolution”. Wybierz „Alpha Blending”, aby uwydatnić powierzchnie guza.</li>
	<li>Zoptymalizuj obraz trójwymiarowy do prezentacji. Powiększ obraz guza oraz powiązanych IG i przytnij go w razie potrzeby. Obróć obraz w płaszczyznach xyz i dostosuj tablice LUT.</li>
	<li>Przechwyć obraz do prezentacji. Wybierz „Edit- Create View Snapshot (8 bit RGB)”. Nazwij i zapisz plik w odpowiedni sposób.</li>
</ol>
9. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig1.jpg" alt="mysi model formowania guza; iniekcja komórek LifeAct-mCherry; schemat mikroskopii dwufotonowej." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Ogólny schemat ilustrujący kluczowe etapy powstawania ortotopowego guza języka oraz obrazowania dwufotonowego in situ.
<img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig2.jpg" alt="Procedura iniekcji u gryzoni, warunki laboratoryjne, badania biomedyczne, technika eksperymentalna." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Iniekcja komórek OSC19 wykazujących ekspresję LifeAct-mCherry do języka myszy.
<img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig3.jpg" alt="Próbka tkanki w kasecie biopsyjnej; preparat histologiczny do analizy mikroskopowej, badanie naukowe." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3 Wycięty język myszy z guzem, przygotowany do obrazowania dwufotonowego.
<img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig4.jpg" alt="Układ mikroskopii optycznej; analiza emisji fluorescencji; eksperyment mikroskopowy; obserwacja komórek." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Orientacja języka z guzem w pozycji w mikroskopie dwufotonowym, przygotowana do obrazowania.
<img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig5.jpg" alt="Interfejs przetwarzania obrazów mikroskopowych z analizą fluorescencji; łączenie kanałów i konfiguracja ustawień." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Reprezentatywny zrzut ekranu z programu ScanImage prezentujący akwizycję surowych danych początkowego obrazu dwufotonowego.
<img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig6.jpg" alt="Rendering Voltex, obraz po progowaniu, analiza IG, wykres rozrzutu odległości względem objętości, mikroskopia." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Analiza obrazu i kwantyfikacja naciekania guza 
w ortotopowym modelu guza OSC19. Reprezentatywne zrzuty ekranu z
renderowania Amira Voltex (A) oraz pojedynczego przeprogowanego przekroju osi z (B), 
na których guz pierwotny zaznaczono kolorem fioletowym, grupę inwazyjną 1 (IG-1) 
kolorem niebieskim, IG-2 kolorem czerwonym i IG-3 kolorem zielonym, jako przykład procedury identyfikacji. Grot strzałek oznacza grupy IG w 
(A) i (B). C. Wykresy objętości względem odległości naciekania dla ośmiu 
poszczególnych grup IG wykorzystanych do obliczenia indeksu naciekania guza (Ti).
<img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig7.jpg" alt="Analiza obrazowania histologicznego i 3D sekcji tkanek; pokazano mikroskopię i rekonstrukcję 3D." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7. Reprezentatywne obrazy nowotworów i grup komórek nowotworowych naciekających uzyskane zgodnie z niniejszym protokołem w porównaniu z obrazami uzyskanymi za pomocą konwencjonalnego podejścia IHC. A. Przekrój parafionowy całego języka mysiego z ortotopowym nowotworem UMSCC1. Barwienie immunohistochemiczne przeprowadzono zgodnie z konwencjonalnymi procedurami, stosując przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko specyficznemu dla HNSCC markerowi komórkowemu emmprin (Zymed; kat. nr 34-5600) w rozcieńczeniu 1:1000, a wizualizację wykonano przy użyciu zestawu detekcyjnego OmniMap DAB anti-Rb (Ventana kat. nr 760-149), a następnie zastosowano barwienie hematoksyliną żelazową. Obrazy obejmujące cały obszar języka zbierano pojedynczo przy powiększeniu 4X przy użyciu mikroskopu Olympus ZX70 Provis z kamerą Optronics MicroFire CCD i zrekonstruowano za pomocą pakietu obrazowania StereoINvestigator (MBF Bioscience). Nowotwór jest widoczny na czubku języka. Powiększony obszar ukazujący front inwazyjny i poszczególne grupy komórek nowotworowych (groty strzałek) przedstawiono w (B). C. Rendering Nikon NIS-Elements reprezentatywnego nowotworu OSC19. Widoczny jest zwiększony detal konturów oraz wyraźna wizualizacja IG (groty strzałek). Paski skali na wszystkich obrazach = 100 μm.

<ol><li>Sano, D., Myers, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenograft+models+of+head+and+neck+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck+Oncol%22%5BJournal%5D)">Xenograft models of head and neck cancers.</a> Head Neck Oncol. 1, 32-32 (2009).</li>
<li>Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+cancer+in+the+head+and+neck+region%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Animal models of cancer in the head and neck region.</a> Clin Exp Otorhinolaryngol. 2, 55-60 (2009).</li>
<li>Myers, J. N., Holsinger, F. C., Jasser, S. A., Bekele, B. N., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+nude+mouse+model+of+oral+tongue+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An orthotopic nude mouse model of oral tongue squamous cell carcinoma.</a> Clin Cancer Res. 8, 293-298 (2002).</li>
<li>Sano, D., Myers, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+of+squamous+cell+carcinoma+of+the+oral+tongue%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Metastasis of squamous cell carcinoma of the oral tongue.</a> Cancer Metastasis Rev. 26, 645-662 (2007).</li>
<li>Sano, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+combination+anti-endothelial+growth+factor+receptor+and+anti-vascular+endothelial+growth+factor+receptor+2+targeted+therapy+on+lymph+node+metastasis%3A+a+study+in+an+orthotopic+nude+mouse+model+of+squamous+cell+carcinoma+of+the+oral+tongue%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">The effect of combination anti-endothelial growth factor receptor and anti-vascular endothelial growth factor receptor 2 targeted therapy on lymph node metastasis: a study in an orthotopic nude mouse model of squamous cell carcinoma of the oral tongue.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 135, 411-420 (2009).</li>
<li>Kupferman, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrkB+induces+EMT+and+has+a+key+role+in+invasion+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">TrkB induces EMT and has a key role in invasion of head and neck squamous cell carcinoma.</a> Oncogene. 29, 2047-2059 (2010).</li>
<li>Ammer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saracatinib+Impairs+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+Invasion+by+Disrupting+Invadopodia+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer+Sci+Ther%22%5BJournal%5D)">Saracatinib Impairs Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Invasion by Disrupting Invadopodia Function.</a> J Cancer Sci Ther. 1, 52-61 (2009).</li>
<li>Rosenthal, E. L., Kulbersh, B. D., King, T., Chaudhuri, T. R., Zinn, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorescent+labeled+anti-epidermal+growth+factor+receptor+antibody+to+image+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Use of fluorescent labeled anti-epidermal growth factor receptor antibody to image head and neck squamous cell carcinoma xenografts.</a> Mol Cancer Ther. 6, 1230-1238 (2007).</li>
<li>Gleysteen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeled+anti-EGFR+antibody+for+identification+of+regional+and+distant+metastasis+in+a+preclinical+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeled anti-EGFR antibody for identification of regional and distant metastasis in a preclinical xenograft model.</a> Head Neck. 30, 782-789 (2008).</li>
<li>Bhirde, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+killing+of+cancer+cells+in+vivo+and+in+vitro+with+EGF-directed+carbon+nanotube-based+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Targeted killing of cancer cells in vivo and in vitro with EGF-directed carbon nanotube-based drug delivery.</a> ACS Nano. 3, 307-316 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ortotopiczne modele mysie okazały się użyteczne w badaniu wielu aspektów nowotworów głowy i szyi1,2. Połączyliśmy dobrze ugruntowany ortotopowy system SCOT3 z obrazowaniem mikroskopowym dwufotonowym komórek znakowanych mCherry, tworząc system do badania wczesnych zdarzeń inwazji komórek nowotworowych głowy i szyi. W tej procedurze zauważyliśmy, że komórki mogą wyciekać z miejsca wstrzyknięcia guza, szczególnie u myszy w wieku sześciu tygodni lub młodszych, ze względu na niewystarczającą wielkość języka. Aby uniknąć tego problemu, stosujemy starsze myszy. Większy rozmiar języka u starszych myszy pomaga również zapobiec pęknięciu tętnicy językowej i nadmiernemu krwawieniu z języka. Przyjęcie się guza jest znacznie zwiększone, gdy w miejscu początkowego wstrzyknięcia występuje gwałtowny obrzęk języka. Obrzęk ten ustępuje w ciągu jednej do dwóch godzin w miarę wchłaniania wstrzykniętego płynu. Wzrost guza staje się widoczny jeden do dwóch tygodni po wstrzyknięciu wskazanej liczby komórek w postaci małego białego guzka na powierzchni języka. Zauważyliśmy również, że przy użyciu obiektywu 40X w przedstawionych tutaj badaniach nie jesteśmy w stanie rozróżnić pojedynczych komórek nowotworowych, ale identyfikujemy IGs jako inwazyjne skupiska komórek, które odzwierciedlają typowy sposób inwazji HNSCC.
Do tej pory model ten był szeroko wykorzystywany do badania roli konkretnych cząsteczek, a także działania kilku leków przeciwnowotworowych na wzrost i inwazję SCOT, przy czym skuteczność mierzono poprzez monitorowanie przerzutów do węzłów chłonnych szyi za pomocą metod IHC lub bioluminescencyjnych4-7. Guzy tworzące się w tym systemie manifestują się blisko powierzchni języka (Rysunek 7), co umożliwia zastosowanie mikroskopii dwufotonowej do obrazowania całych guzów in situ jako inwazyjnych skupisk wielokomórkowych. Procedura ta może być również wykorzystana do wizualizacji inwazji nowotworowej z rozdzielczością komórkową. Mikroskopia dwufotonowa była wcześniej wykorzystywana do badania eksperymentalnych metod leczenia raka głowy i szyi w modelach ortotopowych8,9 i ksenoprzeszczepach8,10. Istnieją jednak dwie główne różnice między tymi raportami a naszym protokołem. Po pierwsze, w badaniach tych stosowano markery zewnątrzkomórkowe do celowania/identyfikacji komórek nowotworowych głowy i szyi, co mogło ograniczyć detekcję jedynie do komórek nowotworowych z szerokim dostępem do krwiobiegu. Po drugie, inwazja komórek nowotworowych w pobliżu miejsca pierwotnego, która prawdopodobnie odzwierciedla wczesną aktywność przerzutową, nie była oceniana jako parametr eksperymentalny. Nasz protokół umożliwia bezpośrednią kwantyfikację inwazji komórek nowotworowych w dowolnym momencie progresji guza w językach myszy. Chociaż opisana tutaj metoda dotyczy procedury z wykorzystaniem wypreparowanych języków, obecnie jesteśmy w trakcie adaptacji tej metody do obrazowania inwazji nowotworowej u żywych myszy, aby w połączeniu z bioluminescencją jednocześnie monitorować wczesną inwazję, zajęcie miejscowych węzłów chłonnych oraz przerzuty odległe u tego samego zwierzęcia. Modyfikacje protokołu dla obrazowania in vivo wymagają zaprojektowania odpowiedniego stołu do pozycjonowania i utrzymania myszy podczas obrazowania, a także praktycznego systemu do prawidłowego nawilżania jamy ustnej znieczulonych myszy podczas procedury obrazowania. Po optymalizacji adaptacje te umożliwią badanie roli potencjalnych cząsteczek proinwazyjnych oraz testowanie związków przeciwinwazyjnych pod kątem inwazji miejscowej i bardziej odległego zajęcia przerzutowego u zwierząt w dłuższych okresach czasu.

obrazowanie wielofotonowe inwazji komórek nowotworowych w ortotopowym modelu mysim dla raka płaskonabłonkowego jamy ustnej

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Inwazja lokalno-regionalna raka głowy i szyi jest powiązana z ryzykiem przerzutowania i stanowi trudne wyzwanie przy projektowaniu i wdrażaniu strategii leczenia pacjentów. Opracowano ortotopowe modele mysie raka jamy ustnej, aby ułatwić badanie czynników wpływających na inwazję oraz służyć jako systemy modelowe do oceny terapii przeciwnowotworowych. W systemach tych wizualizacja rozproszonych komórek nowotworowych w tkankach jamy ustnej była zazwyczaj przeprowadzana za pomocą konwencjonalnej histologii lub przy użyciu in vivo metody bioluminescencyjne. Główną wadą tych technik jest immanentna niemożność dokładnej wizualizacji i kwantyfikacji w trzech wymiarach wczesnej inwazji komórek nowotworowych wywodzących się z ogniska pierwotnego. Przedstawiamy tutaj protokół, który łączy uznany model raka płaskonabłonkowego języka (SCOT) z obrazowaniem dwufotonowym, co umożliwia wielowektorową wizualizację rozprzestrzeniania się nowotworu języka. Linia komórkowa nowotworu głowy i szyi OSC-19 została stabilnie zmodyfikowana w celu ekspresji peptydu wiążącego F-aktynę LifeAct połączonego z białkiem fluorescencyjnym mCherry (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu myszy, którym wstrzyknięto te komórki, niezawodnie wykształcają guzy, które umożliwiają wizualizację języka za pomocą ex vivo zastosowanie mikroskopii dwufotonowej. Technika ta umożliwia ortotopową wizualizację masy guza oraz lokalnie naciekających komórek w wyciętych językach, bez naruszania regionalnego mikrośrodowiska guza. Dodatkowo system ten pozwala na ilościową ocenę inwazji komórek nowotworowych poprzez obliczanie dystansów, na jakie komórki naciekające przemieściły się z miejsca pierwotnego guza. Całość procedury stanowi ulepszony system modelowy do analizy czynników przyczyniających się do inwazji SCOT oraz opracowania metod terapeutycznych ukierunkowanych na zapobieganie lokalnej inwazji i odległym przerzutom. Metoda ta posiada również potencjał do późniejszego połączenia z innymi modalnościami obrazowania w warunkach in vivo.

Przedstawiono kompleksowy przegląd technik wykorzystywanych w tworzeniu mysiego modelu raka jamy ustnej oraz ilościowego monitorowania inwazji nowotworowej w obrębie języka za pomocą mikroskopii wielofotonowej komórek znakowanych. System ten może służyć jako użyteczna platforma do oceny molekularnej oraz skuteczności leków w przypadku związków przeciwinwazyjnych.

Obrazowanie wielofotonowe inwazji komórek nowotworowych w ortotopowym modelu mysim dla raka płaskonabłonkowego jamy ustnej

Lokalno-regionalna inwazja raka głowy i szyi wiąże się z ryzykiem przerzutów i stanowi trudne wyzwanie w projektowaniu oraz wdrażaniu planów leczenia pacjentów...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie mysiego modelu raka jamy ustnej, który umożliwia wizualizację i kwantyfikację naciekania nowotworu w języku. Osiąga się to poprzez wstępne wygenerowanie komórek raka płaskonabłonkowego jamy ustnej do obrazowania dwufotonowego za pomocą infekcji lentiwirusowej Life Act M cherry oraz stabilnej selekcji klonalnej. Następnie tworzy się ortotopowe ksenoprzeszczepy nowotworowe u myszy nago poprzez wstrzyknięcie komórek znakowanych Life Act M cherry do języków znieczulonych myszy.Następnie języki zawierające guzy poddawane są obrazowaniu za pomocą mikroskopii dwufotonowej. W rezultacie możliwe jest uzyskanie wyników wykazujących ilościową ocenę miejscowej inwazji guza jamy ustnej w mięsień języka poprzez obrazowanie dwufotonowe świeżej tkanki języka i późniejszą komputerową rekonstrukcję trójwymiarową guzów pierwotnych oraz regionalnie naciekających grup komórkowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak immunohistochemia czy obrazowanie bioluminescencyjne, jest możliwość ilościowego pomiaru inwazji komórek nowotworowych w trzech wymiarach.Wnioski płynące z zastosowania tej techniki mają znaczenie dla interwencji terapeutycznych w raku jamy ustnej, ponieważ dostarcza ona modelu systemowego do analizy białek zaangażowanych w inwazję nowotworową, a także do oceny związków przedklinicznych w strategiach terapeutycznych przeciwinwazyjnych. Zazwyczaj osoby początkujące w tej technice mogą napotykać trudności, gdyż wstrzykiwanie komórek nowotworowych do języka oraz przygotowanie języka do mikroskopii dwufotonowej są technicznie wymagające i wymagają wprawy oraz praktyki. Wizualizacja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy wstrzykiwania guza i obrazowania dwufotonowego są trudne do opanowania i wymagają specjalistycznych umiejętności. Aby rozpocząć hodowlę.Linie komórkowe nowotworów głowy i szyi człowieka w pożywce kompletnej składającej się z DMEM uzupełnionego o 10% FBS, 1% penicyliny-streptomycyny oraz 1% nieessentialnych aminokwasów. W celu przeniesienia sekwencji kodującej LIFE Act mCherry do wektora lentiwirulowego pLKO.1, w pierwszej kolejności wymagana jest mutogeneza celowana w celu wprowadzenia trzech mutacji synonimicznych do miejsca rozpoznawania SbfI w macierzystym cDNA mCherry. Następnie sekwencję zmodyfikowanego LIFE Act mCherry z flankującymi miejscami EcoRI i SbfI namnożono metodą PCR i subklonowano do pLKO.1. Aby wygenerować konstrukt pLKO.1 LIFE Act mCherry przy użyciu lentiwirulowego systemu ekspresyjnego, linię komórek opakowujących 293T hodowano w pożywce kompletnej do osiągnięcia 17–40% konfluencji.Za pomocą CalFOSS przeprowadź transfekcję komórek wektorami PLL 7.0 LIFE Act M cherry PS PACS 2 oraz P-VSV-G w stosunku odpowiednio 3:2:1. Po 24 godzinach wymień pożywkę na świeżą pożywkę kompletną, a następnie zbieraj i uzupełniaj pożywkę co 12 godzin przez okres 72 godzin, przechowując zebraną pożywkę w temperaturze 4 °C w celu wytworzenia linii komórkowych głowy i szyi ze stabilną ekspresją LIFE Act M cherry. Wirował zebraną pożywkę z prędkością 2000 RPM przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie dodaj 1 mL sklarowanej pożywki zawierającej wirusa do komórek OSC 19 lub USCCC1 na 12 godzin.Przepłucz komórki, a następnie dodaj kolejny jeden mililitr wirusa na kolejne 12 godzin. Hoduj komórki w medium zawierającym 200 mg/mL puromycyny przez dwa tygodnie. Aby wyselekcjonować kolonie oporne, dokonaj wizualnej oceny przeżyłych kolonii pod kątem ekspresji mCherry przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Trypsynizuj poszczególne pozytywne kolonie, używając sterylnych dysków klonujących o średnicy 3 mm.Utrzymywać komórki pozytywne w medium zawierającym 200 mg/ml puromycyny aż do zamrożenia lub wykorzystania do wstrzyknięcia ortotopowego w celu wytworzenia ortotopowego ksenoprzeszczepu nowotworowego. Przenieść komórki nowotworowe wykazujące ekspresję mCherry z użyciem trypsyny, następnie odwirować kulturę i resuspendować około 2,5 × 10⁴ komórek w 50 µL pełnego medium. Przenieść komórki nowotworowe do strzykawki o pojemności 1 mL z założoną igłą 27G o długości pół cala.Następnie znieczul ośmiotygodniową samicę myszy athymicznej (myszy naga) za pomocą kombinacji 80 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny. Gdy zwierzę przestanie się poruszać, nałóż maść nawilżającą do oczu i sprawdź reaktywność, uciskając paznokciem opuszkę stopy.Utrzymuj myszy na podgrzewanej podkładce w temperaturze od 37 do 40 °C. Za pomocą sterylnej pęsety delikatnie chwyć czubek języka i wyciągnij go z jamy ustnej. Powoli wstrzyknij komórki w jedną stronę każdego języka, aby utworzyć grudkowatą masę w centrum języka.Wstrzyknąć myszom 2,1 mg/kg johimbiny i umieścić je ponownie na podkładce grzewczej, aby monitorować je podczas wybudzania z narkozy. Umieścić myszy w sterylnych klatkach zawierających miękką dietę transgeniczną. Ważyć myszy co dwa do trzech dni i monitorować je wizualnie pod kątem pojawienia się guza.Aby przygotować języki myszy do obrazowania ex vivo, przeprowadź eutanazję myszy z nowotworami w różnych punktach czasowych. Po uśpieniu zwierząt metodą inhalacji dwutlenkiem węgla, wyciąć języki i przepłukać je roztworem XPBS. Następnie użyć monofilamentowej nici krawieckiej z lokalnego sklepu z artykułami hobbystycznymi oraz igły krawieckiej rozmiaru 8.Przymocuj język do jednej strony konwencjonalnej kasety do zatapiania tkanek w parafinie. Po unieruchomieniu języka zanurz cały zespół kasety w roztworze XPBS. Natychmiast poddaj języki badaniu z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej w celu wykonania obrazowania.Zanurz kasety z językiem w 60 milimetrowym naczyniu zawierającym 1XPBS. Zabezpiecz naczynie w uchwycie o specjalnej konstrukcji na wysuwanym ramieniu wspornikowym umieszczonym pod obiektywem mikroskopu dwufotonowego. Umieść obiektyw zanurzeniowy z wodą o powiększeniu 40 x i aperturą numeryczną 0,8 bezpośrednio na widocznej zmianie nowotworowej lub nad nią.Wykonaj obrazowanie języka za pomocą mikroskopii dwufotonowej z wykorzystaniem tytanowego lasera szafirowego o intensywności 60 mW i długości fali wejściowej 755 nm. Aby zoptymalizować sygnał mCherry, wykonaj seryjne obrazy skanowania laserowego co 1 µm na głębokościach przyrostowych 1 µm, obejmując całkowitą głębokość tkanki od 15 do 100 µm. Przy tej konfiguracji można analizować guzy o głębokości w tkance do 1 mm.Do przechwytywania obrazów należy użyć funkcji scan image. Funkcja scan image generuje dwukanałowy wyjściowy sygnał wzorców skanowania rastrowego do sterowania galwanometrycznymi lustrami skanującymi XY, a jednocześnie przechwytuje do czterech kanałów sygnałów wejściowych z fotopowielaczy za pomocą karty akwizycji danych. Scan image umożliwia zbieranie obrazów w stosie Z (Z stack) poprzez sterowanie osią Z obiektywu oraz rejestrowanie obrazów time-lapse w trybie pojedynczym lub cyklicznym.Zapisz obrazy w jednym pliku TIF z głębią bitową 16 bit. Używając oprogramowania Amira, wyrenderuj stosy obrazów guza w jeden obraz trójwymiarowy poprzez otwarcie pliku TIF zawierającego zestaw obrazów z serii Z. Użyj funkcji TEX, aby wygenerować rendering trójwymiarowy.Na przetworzonym obrazie prawdopodobnie pojawi się obraz dużego guza pierwotnego wraz z kilkoma mniejszymi, oddzielonymi grupami inwazyjnymi (ig). Aby zmierzyć objętość guza, należy zdefiniować próg dla obszaru guza pierwotnego oraz dla każdego przekroju stosu obrazów, korygując i eliminując fluorescencję tła. Powtórz procedurę progowania dla każdej grupy inwazyjnej.Po wybraniu guza pierwotnego oraz wszystkich grup inwazyjnych (igs), określ pomiar objętości oraz współrzędne OID guza w osiach X, Y i Z dla guza pierwotnego. Aby obliczyć odległości grup inwazyjnych od centralnego punktu guza, oblicz indeks inwazyjności guza (ti) korzystając ze wzoru: ti równa się NT razy VT razy dt. Gdzie NT oznacza całkowitą liczbę grup inwazyjnych na obrazie, VT oznacza całkowitą objętość wszystkich grup inwazyjnych, a DT oznacza całkowitą odległość przebytą przez wszystkie grupy inwazyjne od centrum guza pierwotnego.Trójwymiarowe renderingi z większą szczegółowością topograficzną można wygenerować poprzez import oryginalnych 16-bitowych monochromatycznych plików końcówki do programu Nikon NIS elements. Utwórz plik ND ze stosu obrazów. Następnie ręcznie skalibruj dokument, aby określić rozmiar piksela w celu uzyskania renderingów o wyższej jakości.Dodaj dodatkowe przekroje w płaszczyźnie Z. Na tym rysunku przedstawiono przykład surowych danych pozyskanych z obrazowania dwufotonowego za pomocą oprogramowania NIS Elements lub lustra. Do rekonstrukcji surowych danych guzów języka, zaprezentowanych na tym rysunku, można wykorzystać oprogramowanie.Ten panel przedstawia przykład renderowania trójwymiarowego z wykorzystaniem funkcji TEX w oprogramowaniu Amira. Poniżej znajduje się przykład progowania pojedynczego przekroju dwufotonowego ze stosu obrazów w celu zidentyfikowania grup naciekających z guza pierwotnego, a także centrum guza pierwotnego (oid). Po przeanalizowaniu każdego przekroju poddanego progowaniu, program Amira określa objętość oraz dystans przebyty przez każdą grupę naciekającą od centrum.Dane te można przedstawić graficznie i wykorzystać do uzyskania wartości liczbowej całkowitego stopnia naciekania komórek nowotworowych. Przedstawione tutaj obrazy reprezentatywne dla miejsca pierwotnego ukazują guzy zwizualizowane za pomocą konwencjonalnego patologicznego znakowania immunohistochemicznego w porównaniu z obrazem trójwymiarowym podobnego guza uzyskanym zgodnie z opisanym protokołem. Po opanowaniu techniki, od momentu wycięcia języka do końcowego renderowania 3D, procedura ta może zostać przeprowadzona w około dwie godziny, jeśli jest wykonana prawidłowo. Podczas realizacji tej procedury należy uważać, aby nie przebić igłą języka na wylot, co mogłoby doprowadzić do utraty komórek nowotworowych i utrudnić pobranie guza. Po wykonaniu tej procedury można przeprowadzić testy związków terapeutycznych lub komórek z manipulowanym poziomem białek w celu określenia ich skuteczności w hamowaniu naciekania raka jamy ustnej.W warunkach in vivo należy pamiętać, że praca z ludzkimi komórkami nowotworowymi zmodyfikowanymi za pomocą lentiwirusa jest niebezpieczna; podczas pracy z myszami po iniekcji należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie odpowiednich środków ochrony indywidualnej i praca w certyfikowanym dygestorium z laminarnym przepływem powietrza poziomu BSL 2.

multi-photon-imaging-tumor-cell-invasion-an-orthotopic-mouse-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Obrazowanie wielofotonowe inwazji komórek nowotworowych w ortotopowym mysim modelu raka płaskonabłonkowego jamy ustnej

Aby zbadać wzrost guza oraz mikrośrodowisko nowotworowe in vivo, zastosowaliśmy syngeniczny i ortotopowy model raka jajnika u immunokompetentnych myszy. Przetransdukowaliśmy linię komórkową nowotworu mysiego (MOV1) białkiem fluorescencyjnym Katushka (MOV1KAT), a w niniejszej pracy przedstawiamy sposób jej ortotopowej implantacji do jajnika oraz obrazowanie in vivo.

Ortotopowy model surowiczego raka jajnika u immunokompetentnych myszy do obrazowania guzów in vivo i monitorowania odpowiedzi immunologicznych guza

Obrazowanie bioluminescencyjne aktywności czynnika indukowanego hipoksją-1α jest stosowane do monitorowania rozwoju hipoksji guza wewnątrzczaszkowego w mysim modelu przerzutów raka piersi do mózgu.

In vivo obrazowanie bioluminescencyjne dynamiki niedotlenienia guza w przerzutach raka piersi do mózgu w modelu mysim

W tym filmie rozwijamy ortotopowy model mysiego raka głowy i szyi poprzez dośluzówkowe inokulację linii komórkowej raka płaskonabłonkowego. Mysz z nowotworem wykazywałaby podobieństwo do klinicznie istotnych objawów choroby u ludzi, a zatem może być wykorzystana do badania progresji raka i odkrywania nowych strategii terapeutycznych.

Dośluzówkowa inokulacja komórek rakowych w modelu mysim: procedura mająca na celu ustalenie ortotopowego mysiego modelu raka głowy i szyi

Opisujemy metodę obrazowania odpowiedzi na leczenie przeciwnowotworowe in vivo i w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Obrazowanie na żywo odpowiedzi na leki w mikrośrodowisku guza w mysich modelach raka piersi

Ustaliliśmy korowy model glejaka ortotopowego u myszy do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej, który podsumowuje ograniczenia biofizyczne, które normalnie występują podczas wzrostu guza. Przewlekłe szklane okienko zastępujące czaszkę nad guzem umożliwia śledzenie postępu guza w czasie za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Ortotopowy mysi model glejaka wielopostaciowego utrzymujący fizyczne ograniczenia miąższu mózgu i nadający się do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej

Opisany jest ortotopowy model pierwotnego guza raka piersi i chirurgiczne usunięcie pierwotnego guza w celu przedłużenia życia myszy w celu wytworzenia spontanicznych przerzutów. Wzrost i progresja guza są monitorowane i oznaczane ilościowo za pomocą obrazowania fluorescencyjnego lucyferazy.

Ortotopowy mysi model spontanicznych przerzutów raka piersi

Tutaj prezentujemy powtarzalną metodę tworzenia ortotopowego mysiego modelu raka płaskonabłonkowego głowy i szyi. Guzy wykazują klinicznie istotne cechy histopatologiczne choroby, w tym martwicę, słabe różnicowanie, przerzuty węzłowe i naciek immunologiczny. U myszy z guzem rozwijają klinicznie istotne objawy, w tym dysfagię, przemieszczenie szczęki i utratę wagi.

Dośluzówkowa inokulacja komórek raka płaskonabłonkowego u myszy w celu profilowania immunologicznego guza i oceny odpowiedzi na leczenie

Manuskrypt opisuje metodologię ustalania oraz monitorowania wzrostu podłużnego spontanicznych przerzutów do płuc z ortotopowo wstrzykiwanych guzów piersi, które mogą być interwencyjne na wszystkich etapach kaskady przerzutowej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie w celu pomiaru spontanicznych przerzutów do płuc komórek guza piersi wstrzykniętych ortotopowo

Niniejszy protokół opisuje implantację i ocenę czerniaka w mysim naczyniówce za pomocą optycznej koherentnej tomografii.

Implantacja i ocena czerniaka w mysim naczyniówce za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Tłumaczenie wyników mikroskopii przyżyciowej jest utrudnione ze względu na jego płytką głębokość penetracji w tkanki. W tym miejscu opisujemy mysi model komory z oknem grzbietowym, który umożliwia jednoczesną rejestrację mikroskopii przyżyciowej i klinicznie stosowanych metod obrazowania (np. CT, MRI) w celu bezpośredniej korelacji przestrzennej, potencjalnie usprawniając kliniczne tłumaczenie wyników mikroskopii przyżyciowej.

Mysi model guza w komorze grzbietowego fałdu skórnego do połączonej mikroskopii przyżyciowej i obrazowania metodą rezonansu magnetycznego w translacyjnych badaniach nad rakiem

Unikalna metoda chirurgicznej resekcji raka płaskonabłonkowego jamy ustnej powstałych w jamie ustnej została przedstawiona tutaj.

Translacyjnie istotny model resekcji guza dla przedklinicznych modeli myszy raka płaskonabłonkowego jamy ustnej

Poznaj metodę obrazowania wielofotonowego inwazji komórek nowotworowych w ortotopowym mysim modelu raka jamy ustnej. Technika umożliwia trójwymiarową wizualizację i ilościową ocenę terapii przeciwzapalnych.

Obrazowanie wielofotonowe inwazji komórek nowotworowych w ortotopowym modelu mysim dla raka płaskonabłonkowego jamy ustnej

Przeglądaj więcej filmów