Obrazowanie wielofotonowe inwazji komórek nowotworowych w ortotopowym mysim modelu raka płaskonabłonkowego jamy ustnej

Przedstawiono obszerny przegląd technik związanych z generowaniem mysiego modelu raka jamy ustnej i ilościowym monitorowaniem inwazji guza w obrębie języka za pomocą mikroskopii wielofotonowej znakowanych komórek. System ten może służyć jako użyteczna platforma do oceny molekularnej i skuteczności leków związków przeciwinwazyjnych.

Ogólnym celem tej procedury jest wyprodukowanie mysiego modelu raka jamy ustnej, który umożliwia wizualizację i ilościowe określenie inwazji guza na języku. Osiąga się to poprzez najpierw wygenerowanie komórek raka płaskonabłonkowego jamy ustnej do obrazowania dwóch fotonów za pomocą lentiwirusowej infekcji życia Act M wiśni i stabilnej selekcji klonalnej. Następnie ortotopowe guzy ksenoprzeszczepu są wytwarzane u nagich myszy przez wstrzyknięcie żywych komórek oznaczonych wiśnią Act M do języków znieczulonych myszy.

Następnie języki zawierające guz są obrazowane za pomocą dwóch mikroskopów fotonowych. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują ilościowo określoną miejscową inwazję guza jamy ustnej w obrębie mięśnia języka poprzez obrazowanie dwufotonowe świeżej tkanki języka, a następnie wspomaganą komputerowo trójwymiarową rekonstrukcję guzów pierwotnych i regionalnie zaatakowanych grup komórkowych. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak immunohistochemia czy obrazowanie bioluminescencyjne, jest to, że inwazję komórek nowotworowych można mierzyć ilościowo w trzech wymiarach.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku interwencji terapeutycznej raka jamy ustnej, ponieważ zapewnia ona modelowy system do analizy białek zaangażowanych w inwazję guza, a także oceny związków przedklinicznych w zakresie przeciwinwazyjnych strategii terapeutycznych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby początkujące w tej technice będą miały trudności, ponieważ wstrzyknięcie komórek nowotworowych do języka i przygotowanie języka do dwóch mikroskopii fotograficznej jest technicznie wymagające, wymaga umiejętności i praktyki. Wizualizacja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ wstrzyknięcie guza w dwóch krokach fotonowych jest trudne do nauczenia i wymaga specjalistycznych umiejętności, aby rozpocząć hodowlę.

Linie komórkowe nowotworów głowy i szyi człowieka w kompletnej pożywce składającej się z DMEM uzupełnionego o 10% FBS, 1% penicylinę streptomycynę i 1% aminokwasy endogenne. W celu przeniesienia sekwencji otoczki wiśni LIFE Act M do PLL 7.0 wymagana jest najpierw ukierunkowana mutageneza miejsca wektora lentiwirusowego, aby wprowadzić trzy ciche mutacje do SBF: jedno miejsce rozpoznawania w macierzystym mCherry CD NA. Następnie PCR wzmacnia sekwencję Zmodyfikowanego Aktu Życia mCherry z flankowaniem ECO R jednego SBF jednego miejsca i sub clent do PLL 7.0. Aby wygenerować konstrukt wiśni PLL 7.0 LIFE Act M po hodowli systemu ekspresji lentiwirusa, linia komórkowa opakowania 2 9 3 T 17 do 40% konfluencji w kompletnym pożywce.

Za pomocą Cal Foss transfekuj komórki wektorami PLL 7.0 LIFE Act M, cherry PS, PACS two i P-V-S-V-G w stosunku odpowiednio trzy do dwóch do jednego. Po 24 godzinach zastąp pożywkę świeżą, kompletną pożywką, zbieraj i uzupełniaj pożywkę co 12 godzin przez 72 godziny, a następnie przechowuj zebraną pożywkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby wytworzyć linie komórkowe głowy i szyi o stabilnej żywotności Ekspresja wiśni Act M. Wirować pobraną pożywkę z prędkością 2000 obr./min przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, dodać jeden mililitr oczyszczonej pożywki zawierającej wirusa do jednej komórki OSC 19 lub US CCC przez 12 godzin.

Opłucz komórki, a następnie dodaj dodatkowy jeden mililitr wirusa na kolejne 12 godzin. Hoduj komórki w pożywce zawierającej 200 miligramów na mililitr pur mycyny przez dwa tygodnie Aby wybrać odporne kolonie, wizualnie przebadaj kolonie, które przeżyły, na całe życie. Działaj m ekspresja wiśni za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej trypsyna, oczy pojedyncze dodatnie kolonie przy użyciu sterylnych trzymilimetrowych krążków klonujących.

Utrzymuj dodatnie komórki w pożywce zawierającej 200 miligramów na mililitr pur mycyny do momentu ponownego zamrożenia lub użycia do wstrzyknięcia ortotopowego w celu wytworzenia ortotopowego ksenoprzeszczepu trypsyny życia Act. Komórki nowotworowe z ekspresją wiśni M, a następnie odwiruj hodowlę i ponownie zawieś około 2,5 razy 10 do czwartej komórki w 50 mikrolitrach kompletnej pożywki. Załaduj komórki nowotworowe do jednomililitrowej strzykawki przymocowanej do igły o średnicy 27 cali i średnicy 27.

Następne znieczulenie, ośmiotygodniowa samica lisa atymicznego. Jedna naga mysz z kombinacją 80 miligramów na kilogram ketaminy i 10 miligramów na kilogram ksylazyny. Gdy zwierzę przestanie się ruszać, nałóż maść nawilżającą oczy i sprawdź, czy reaguje, wciskając paznokieć w opuszkę stopy.

Utrzymuj myszy na poduszce grzewczej w temperaturze od 37 do 40 stopni Celsjusza. Za pomocą sterylnych kleszczy delikatnie chwyć czubek języka i wyciągnij go z jamy ustnej. Powoli wstrzyknij komórki po jednej stronie każdego języka, aby utworzyć bulwiastą masę w środku języka.

Wstrzyknij myszom 2,1 miligrama na kilogram yohi i zwróć je do poduszki grzewczej, aby monitorować je podczas rekonwalescencji po znieczuleniu. Umieść myszy w sterylnych klatkach zawierających miękką dietę z ciasta transgenicznego. Waż myszy co dwa do trzech dni i monitoruj je wizualnie pod kątem wystąpienia nowotworu.

Aby przygotować języki myszy do obrazowania ex vivo, należy poddać eutanazji myszy z guzami w różnych punktach czasowych. Za pomocą inhalacji dwutlenkiem węgla wyciągnij języki i opłucz je jednym XPBS. Następnie użyj nici do szycia z żyłki z lokalnego sklepu hobbystycznego i igły do szycia w rozmiarze ósmym.

Przymocuj język do jednej strony konwencjonalnej kasety do zatapiania tkanki parafinowej. Po unieruchomieniu języka zanurz cały zespół kasety w jednym XPBS. Natychmiast przetwórz języki za pomocą mikroskopii fotonowej, aby zobrazować języki za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Zanurz kasety z językiem w 60-milimetrowej naczyniu zawierającej jeden XPBS. Zamocuj czaszę w niestandardowym uchwycie na wysuwanym ramieniu wspornikowym umieszczonym pod obiektywem mikroskopu dwufotonowego. Umieść soczewkę obiektywu zanurzającego w wodzie o aperturze numerycznej 40 x 0,8 bezpośrednio na lub nad widoczną zmianą nowotworową.

Zobrazuj język za pomocą dwóch mikroskopii fotonowych z laserem tytanowo-szafirowym o intensywności 60 miliwatów i długości fali wejściowej 755 nanometrów. Aby zoptymalizować sygnał wiśni M, należy zbierać seryjne obrazy skanowania laserowego o długości jednego mikrometra na głębokości przyrostowej jednego mikrometra na całkowitej głębokości tkanki od 15 do 100 mikrometrów. Dzięki tej konfiguracji można analizować guzy o głębokości do jednego milimetra tkanki.

Użyj skanowanego obrazu, aby uchwycić obrazy. Skanowany obraz generuje dwukanałowe wyjście rastrowych wzorców skanowania w celu sterowania metrycznymi lustrami skanowania XY galvan i jednocześnie przechwytuje maksymalnie czterokanałowy sygnał wejściowy jednocześnie z lamp powielacza zdjęć przez kartę akwizycji danych. Skanuj obraz zbiera obrazy stosu Z poprzez sterowanie osią Z obiektywu i zbiera obrazy poklatkowe w trybie pojedynczym lub cyklicznym.

Zapisz obrazy w jednym pliku TIF z 16-bitową głębią. Korzystając z oprogramowania Amira, renderuj stosy obrazów guza w pojedynczy trójwymiarowy obraz, otwierając plik TIF zawierający zestaw obrazów stosu Zs. Użyj funkcji TEX, aby wygenerować renderowanie trójwymiarowe.

Duży obraz guza pierwotnego z kilkoma mniejszymi zdysocjowanymi grupami inwazyjnymi lub ig będzie prawdopodobnie obecny na renderowanym obrazie. Aby zmierzyć objętość guza, zdefiniuj próg obszaru guza pierwotnego, a każdy wycinek stosu obrazów skoryguj i wyeliminuj fluorescencję tła. Powtórz procedurę progowania dla każdej grupy inwazyjnej.

Po wybraniu guza pierwotnego i wszystkich ig określ pomiar objętości, a także współrzędne OID guza X, Y i Z dla guza pierwotnego. Aby obliczyć odległości igs od centralnego punktu guza, oblicz wskaźnik inwazyjności guza lub ti za pomocą ti równego N NT razy VT razy dt. Gdzie NT równa się całkowitej liczbie ig w obrazie, VT równa się całkowitej objętości wszystkich ig, a DT równa się całkowitej odległości przebytej przez wszystkie grupy inwazyjne od środka guza pierwotnego.

Trójwymiarowe renderingi z większą szczegółowością topograficzną można wygenerować, importując oryginalne 16-bitowe monochromatyczne pliki końcówek do elementów Nikon NIS w oprogramowaniu. Utwórz plik ND ze stosu obrazów. Następnie ręcznie skalibruj dokument, aby określić rozmiar piksela w celu uzyskania wyższej jakości renderingu.

Dodaj dodatkowe plasterki w płaszczyźnie Z. Rysunek przedstawia przykład surowych danych uzyskanych z dwufotonowego obrazu, elementów NIS lub lustra. Oprogramowanie może być użyte do rekonstrukcji surowych danych guzów języka, które pokazano na tym rysunku.

Ten panel pokazuje przykład renderowania trójwymiarowego przy użyciu funkcji TEX w oprogramowaniu Amira. Oto przykład progowania pojedynczego odcinka dwóch fotonów ze stosu obrazów w celu identyfikacji grup inwazyjnych z guza pierwotnego, a także pierwotnego centrum guza lub oidu. Po przeanalizowaniu każdego odcinka progowego, Amira określa ilościowo objętość i odległość przebytą przez każdą grupę inwazyjną z Centro.

Dane te można przedstawić graficznie i wykorzystać do uzyskania wartości liczbowej dla pełnego poziomu inwazji komórek nowotworowych. Pokazane tutaj miejsce pierwotne można przypisać reprezentatywne obrazy guzów wizualizowane za pomocą konwencjonalnego patologicznego znakowania immunohistochemicznego w porównaniu z trójwymiarowym obrazem podobnego guza przy użyciu opisanego protokołu Po opanowaniu od punktu ekstrakcji języka do końcowego renderowania 3D, technikę tę można wykonać w około dwie godziny, jeśli zostanie prawidłowo wykonana podczas próby tej procedury, uważaj, aby nie przebić języka igłą, tracąc w ten sposób komórki nowotworowe i utrudniając przyjmowanie guza Postępuj zgodnie z tą procedurą. Można przeprowadzić badania związków terapeutycznych lub komórek ze zmanipulowanymi poziomami białek w celu określenia ich skuteczności w przypadku inwazji raka jamy ustnej.

W warunkach in vivo, nie zapominaj, że praca z ludzkimi komórkami nowotworowymi zmodyfikowanymi lentiwirusem to niebezpieczne środki ostrożności, takie jak odpowiednie środki ochrony osobistej i praca w BSL dwa certyfikowane kaptury z przepływem laminarnym powinny być zawsze podejmowane podczas pracy z myszami, którym wstrzyknięto.