Name: Wysokoprzepustowe badania przesiewowe aktywności endoglukanazy grzybowej w Escherichia coli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Poznaj metodę wysokoprzepustowego badania aktywności endoglukanazy grzybowej w Escherichia coli z wykorzystaniem barwnika Congo Red. Technika umożliwia szybką ocenę aktywności enzymatycznej bez konieczności puryfikacji białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana przez Gordon and Betty Moore Foundation oraz UNCF/Merck Science Initiative.

1. Przygotowanie płyt do przesiewania
<ol>
	<li>Do 1 L wody destylowanej dodać 25 g pożywki wzrostowej LB, 15 g agaru oraz 1,5 g podłoża z karboksymetylocelulozy (CMC), a następnie wysterylizować w autoklawie.</li>
	<li>Po autoklawowaniu pozwolić pożywce ostygnąć, a następnie dodać odpowiednie antybiotyki oraz IPTG do stężenia końcowego 100μM.</li>
	<li>Nalać po 200 mL pożywki do 5 dużych kwadratowych szalek Petriego/tacek do testów biologicznych (240 x 240 x 20 mm lub większych). Pozostawić płytki do całkowitego wyschnięcia.</li>
</ol>

2. Generowanie i przesiew biblioteki endoglukanaz
<ol>
	<li>Wygenerować bibliotekę domen katalitycznych endoglukanazy. Może to zostać osiągnięte na wiele sposobów (np. poprzez mutogenezę celowaną lub losową, rekombinację itp.), zależnie od decyzji badacza. </li>
	<li>Sklonować bibliotekę do wektora w taki sposób, aby znajdowały się one pod kontrolą promotora T7 z operatorem lac i zawierały sekwencję sygnałową pelB w celu kierowania do periplazmy. Przykładem odpowiedniego wektora jest pET22b(+) od Novagen.</li>
	<li>Przetransformować bibliotekę endoglukanazy do szczepu E. coli BL21 (DE3) i wysiać na płytki w celu uzyskania pojedynczych kolonii. </li>
	<li>Inkubować transformaty przez noc w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych wykałaczek zaszczepić klony na 96-dołkowe płytki głębokie zawierające 400μL podłoża LB z dodatkiem odpowiednich antybiotyków. Inkubować przez noc w temperaturze 37°C przy wstrząsaniu z prędkością 250 rpm.</li> 
	<li>Do nocnych kultur w płytkach 96-dołkowych dodać sterylny glicerol do stężenia końcowego 10% w celu długoterminowego przechowywania w temperaturze -80°C. Będzie to płytka matrycowa.</li>
	<li>Za pomocą stempla 96-pinowego przenieść nocne kultury z płytek na płytki przesiewowe zawierające IPTG i CMC. Na każdą płytkę przesiewową można przenieść do 5 zestawów nocnych kultur.</li> 
	<li>Oznaczyć płytki przesiewowe w taki sposób, aby znana była tożsamość i orientacja każdej płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Inkubować przeniesione biblioteki w temperaturze pokojowej (17-25°C) przez noc lub do momentu pojawienia się widocznych kolonii.</li>
	<li>Płukać płytkę wodą destylowaną, aż do całkowitego usunięcia śladów kolonii.</li>
	<li>Wylać czerwień kongową (CR; 0,5% w wodzie) na wypłukaną płytkę. Należy dodać tylko tyle CR, aby pokryć całą płytkę.</li>
	<li>Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Nie przekraczać 15 minut inkubacji w CR. Dłuższy czas inkubacji spowoduje powstanie mniej wyraźnych halo.</li>
	<li>Odlać CR i dodać obfitą ilość (więcej niż potrzeba do pokrycia płytki) 1M NaCl.</li>
	<li>Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. </li>
	<li>Odlać NaCl, aby odsłonić halo degradacji CMC. W celu uzyskania lepszej rozdzielczości halo może być wymagany dłuższy czas inkubacji z NaCl lub wielokrotne płukanie NaCl.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej wykałaczki wyizolować klony aktywnych enzymów z płytki matrycowej do dalszej charakterystyki.</li>
</ol>

3. Reprezentatywne wyniki:
Przykład odczytu dla tego wysokoprzepustowego przesiewu przedstawiono na Rysunku 3. Klony można zidentyfikować jako nieaktywne, słabo aktywne oraz silnie aktywne na podstawie wielkości stref degradacji. Jest to szczególnie przydatne, jeśli w bibliotece znajduje się enzym o znanej aktywności jako referencja. Jak tu pokazano, identyfikacja aktywnych enzymów jest wiarygodna i powtarzalna. Należy jednak pamiętać, że prawidłowe oznakowanie płytek przesiewowych jest niezwykle ważne. Badacz musi być w stanie zidentyfikować aktywne warianty po wypłukaniu kolonii, aby móc wyizolować je z płyty matki przechowywanej w -80°C do dalszej charakterystyki. Wreszcie, trudno jest ocenić a priori zależność między aktywnościami na substratach sztucznych a naturalnymi. Dlatego badacz musi przetestować wszystkie pozytywne klony na materiale istotnym przemysłowo, aby określić przydatność białka.
<img src="/files/ftp_upload/2942/2942fig1.jpg" alt="Tworzenie kolonii na płytkach z agarem CMC i IPTG; schemat wzrostu bakterii i halo degradacji CMC." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Schematyczny opis procedury przesiewowej. Komórki są transformowane biblioteką endoglukanaz i wysiewane selektywnie w celu uzyskania pojedynczych kolonii. Wybrane klony są hodowane przez noc w głębokich płytkach 96-dołkowych w celu (1) przechowywania w -80°C oraz (2) wysiewu metodą replikacji na płytkach zawierających CMC i IPTG w celu indukcji ekspresji endoglukanazy. Aktywne klony są wybierane z płytki matki przechowywanej w -80°C.
<img src="/files/ftp_upload/2942/2942fig2.jpg" alt="Proces edycji genów; schemat mapy plazmidu z operonem lac i promotorem; wyniki eksperymentu na szalkach z agarem." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Klonowanie i ekspresja grzybiczych domen katalitycznych w E. coli. (A) Wektor ekspresyjny endoglukanazy. Geny sklonowano do pET22b(+) (Novagen) pod kontrolą promotora T7. (B) Panel prawy: kolonie BL21 (DE3) wykazujące ekspresję endoglukanazy. Panel lewy: halo degradacji CMC po przemyciu i wybarwieniu czerwienią Kongowego.
<img src="/files/ftp_upload/2942/2942fig3.jpg" alt="Porównanie aktywności białek, wynik elektroforezy; oznaczone jako wysoce i słabo aktywne." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. Przykładowe wyniki przesiewania CMC/Czerwienią Kongową. Zdjęcia płytek przesiewowych wykonane po przemyciu i wywoływaniu Czerwienią Kongową. Wszystkie kolonie na płytkach przesiewowych były o podobnej wielkości.

<ol><li>Atsumi, S., Hanai, T., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-fermentative+pathways+for+synthesis+of+branched-chain+higher+alcohols+as+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels.</a> Nature. 451, 86-89 (2008).</li>
<li>Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulases+and+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cellulases and biofuels.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 295-299 (2009).</li>
<li>Qin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+endoglucanase+II+from+Trichoderma+reesei+to+improve+the+catalytic+efficiency+at+a+higher+pH+optimum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering endoglucanase II from Trichoderma reesei to improve the catalytic efficiency at a higher pH optimum.</a> J Biotechnol. 135, 190-195 (2008).</li>
<li>Nakazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+endoglucanase+III+%28Cel12A%29+from+Trichoderma+reesei%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of endoglucanase III (Cel12A) from Trichoderma reesei.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 83, 649-657 (2009).</li>
<li>Heinzelman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+family+of+thermostable+fungal+cellulases+created+by+structure-guided+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">A family of thermostable fungal cellulases created by structure-guided recombination.</a> Proc Natl Acad Sci. 106, 5610-5615 (2009).</li>
<li>Heinzelman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCHEMA+recombination+of+a+fungal+cellulase+uncovers+a+single+mutation+that+contributes+markedly+to+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">SCHEMA recombination of a fungal cellulase uncovers a single mutation that contributes markedly to stability.</a> J Biol Chem. 284, 26229-26233 (2009).</li>
<li>Lantz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypocrea+jecorina+CEL6A+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Hypocrea jecorina CEL6A protein engineering.</a> Biotechnol Biofuels. 8, 3-20 (2010).</li>
<li>Mahadevan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+and+CBM+engineering+of+Cel5A+%28Thermotoga+maritima%29%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis and CBM engineering of Cel5A (Thermotoga maritima).</a> FEMS Microbiol Lett. 287, 205-211 (2008).</li>
<li>Nakazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+catalytic+domains+of+Trichoderma+reesei+endoglucanase+I%2C+II%2C+and+III%2C+expressed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the catalytic domains of Trichoderma reesei endoglucanase I, II, and III, expressed in Escherichia coli.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 81, 681-689 (2008).</li>
<li>Wang, H., Jones, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+Macrophomina+phaseolina+endoglucanase+%28EGL+1%29+gene+product+in+bacterial+and+yeast+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Biochem+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Properties of the Macrophomina phaseolina endoglucanase (EGL 1) gene product in bacterial and yeast expression systems.</a> Appl Biochem Biotechnol. 81, 153-160 (1999).</li>
<li>Howard, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+activity+of+a+Phanerochaete+chrysosporium+cellobiohydrolase+%28CBHI.1%29+expressed+as+a+heterologous+protein+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Afr+J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Enzyme activity of a Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase (CBHI.1) expressed as a heterologous protein from Escherichia coli.</a> Afr J Biotechnol. 2, 296-300 (2003).</li>
<li>Howard, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+a+chimeric+Phanerochaete+chrysosporium+cellobiohydrolase+expressed+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Afr+J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterisation of a chimeric Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase expressed from Escherichia coli.</a> Afr J Biotechnol. 3, 349-352 (2004).</li>
<li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Env+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Appl Env Microbiol. 43, 777-780 (1982).</li>
<li>Gilkes, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mode+of+action+and+substrate+specificities+of+cellulases+from+cloned+bacterial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Mode of action and substrate specificities of cellulases from cloned bacterial genes.</a> J Bio Chem. 259, 10455-10459 (1984).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Opisany tutaj protokół umożliwia szybką i wysokoprzepustową identyfikację aktywnych enzymów przy minimalnej manipulacji. Detekcja aktywności jest dość czuła i jakościowo odzwierciedla poziom aktywności wewnątrz komórki. Łatwość użycia sprawia, że metoda ta jest odpowiednia dla szerokiego zakresu bibliotek enzymów, ograniczona jedynie przez funkcjonalną ekspresję w E. coli. Co więcej, tego rodzaju przesiewanie aktywności nie ogranicza się do fungalnych celulaz, lecz może zostać dostosowane do dowolnej aktywności ...

<table><tbody><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1284</td><td></td></tr><tr><td>Czerwień kongijska</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6277</td><td></td></tr><tr><td>Karboksymetyloceluloza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>360384</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1679</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do bioanaliz</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>240845</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowy screening aktywności grzybowej endoglukanazy w escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Enzymy celulazy (endoglukanazy, celobiohydrolazy i β-glukozydazy) hydrolizują celulozę do cukrów prostych, które z kolei mogą zostać przekształcone w alkohole paliwowe1. Potencjał hydrolizy enzymatycznej biomasy celulozowej w celu zapewnienia odnawialnych źródeł energii zintensyfikował wysiłki na rzecz inżynierii celulaz w celu ekonomicznej produkcji paliw2. Szczególne zainteresowanie budzą celulazy grzybowe3-8, które są już wykorzystywane przemysłowo w przetwórstwie spożywczym i tekstylnym.
Identyfikacja aktywnych wariantów w bibliotece mutantów celulaz jest kluczowa dla procesu inżynierii; aktywne mutanty mogą być dalej testowane pod kątem poprawy właściwości i/lub poddane dodatkowej mutagenezie. Efektywną inżynierię celulaz grzybowych utrudniał brak narzędzi genetycznych dla organizmów rodzimych oraz trudności w ekspresji enzymów w gospodarzach heterologicznych. Niedawno Morikawa i współpracownicy opracowali metodę ekspresji w E. coli domen katalitycznych endoglukanaz z H. jecorina3,9, ważnego grzyba przemysłowego zdolnego do wydzielania celulaz w dużych ilościach. Funkcjonalną ekspresję w E. coli zgłoszono również dla celulaz z innych grzybów, w tym Macrophomina phaseolina10 oraz Phanerochaete chrysosporium11-12.
Przedstawiamy metodę wysokoprzepustowego screeningu aktywności grzybowej endoglukanazy w E. coli. (Ryc. 1) Metoda ta wykorzystuje powszechny barwnik mikrobiologiczny czerwień kongową (CR) do wizualizacji enzymatycznej degradacji karboksymetylocelulozy (CMC) przez komórki rosnące na podłożu stałym. Test aktywności wymaga niedrogich odczynników, minimalnych manipulacji i daje jednoznaczne wyniki w postaci stref degradacji („halo”) w miejscu kolonii. Chociaż za pomocą tej metody nie można określić ilościowego pomiaru aktywności enzymatycznej, stwierdziliśmy, że wielkość halo koreluje z całkowitą aktywnością enzymatyczną w komórce. Dalsza charakterystyka poszczególnych pozytywnych klonów pozwoli określić względną sprawność białka.
Tradycyjne testy aktywności CMC/CR z użyciem całych komórek bakteryjnych13 polegają na wylewaniu agaru zawierającego CMC na kolonie, co wiąże się z ryzykiem kontaminacji krzyżowej, lub na inkubowaniu kultur w dołkach z agarem CMC, co jest mniej praktyczne przy eksperymentach na dużą skalę. Przedstawiamy tutaj ulepszony protokół, który modyfikuje istniejące metody płukania14 w badaniu aktywności celulazy: komórki hodowane na płytkach z agarem CMC są usuwane przed barwieniem CR. Nasz protokół znacznie ogranicza kontaminację krzyżową i jest wysoce skalowalny, co umożliwia szybki screening tysięcy klonów. Oprócz enzymów H. jecorina, wyekspresowano i przeselekcjonowano warianty endoglukanazy z Thermoascus aurantiacus oraz Penicillium decumbens (pokazane na Rysunku 2), co sugeruje, że protokół ten ma zastosowanie do enzymów pochodzących z wielu organizmów.

Opisujemy niskokosztową, wysokoprzepustową metodę przesiewania aktywności endoglukanazy grzybowej w E. coli. Metoda opiera się na prostym wizualnym odczycie degradacji substratu, nie wymaga oczyszczania enzymu i jest wysoce skalowalna. Umożliwia to szybkie przesiewanie dużych bibliotek wariantów enzymatycznych.

Wysokoprzepustowy screening aktywności grzybowej endoglukanazy w Escherichia coli

Enzymy celulazy (endoglukanazy, celobiohydrolazy i $\beta$-glukozydazy) hydrolizują celulozę do cukrów prostych, które z kolei mogą zostać przekształcone...

W tym wysokoprzepustowym badaniu aktywności endoglukonanu grzybowego w E. coli zastosowano powszechnie używany barwnik mikrobiologiczny czerwień kongową w celu wizualizacji enzymatycznej degradacji karboksymetylocelulozy przez komórki rosnące na podłożu stałym. Najpierw komórki poddano transformacji biblioteką endoglukonanu i wysiano selektywnie w celu uzyskania pojedynczych kolonii. Następnie wybrano poszczególne klony i inkubowano je przez noc w płytkach 96-dołkowych. Kolejno przeprowadzono przesiew enzymatyczny poprzez przenoszenie kolonii na płytki CMC zawierające IPTG w celu indukcji ekspresji endoglukonanu.Na koniec, aktywne klony są pobierane z płyty matki przechowywanej w temperaturze -80 °C. Analiza ta daje jednoznaczne wyniki w postaci stref degradacji w miejscu kolonii, gdzie wielkość halo koreluje z aktywnością enzymatyczną i pozwala na jakościową ocenę względnej sprawności białka. Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod, takich jak metoda nakładkowa, jest możliwość przeprowadzania analiz wysokoprzepustowych przy bardzo niskim odsetku wyników fałszywie dodatnich.Do jednego litra wody destylowanej dodać 25 g pożywki LB, 15 g agaru oraz 1,5 g podłoża z karboksymetylocelulozy, a następnie wysterylizować w autoklawie. Po ostygnięciu pożywki dodać odpowiednie antybiotyki oraz IPTG do stężenia końcowego 100 µM. Następnie wlać po 200 ml pożywki do pięciu dużych kwadratowych szalek Petriego lub tacek do analiz biologicznych i pozostawić do całkowitego wyschnięcia płytek.Najpierw należy stworzyć bibliotekę domen katalitycznych endoglukonatazy w odpowiednim wektorze, takim jak PET 22 B plus od firmy Novagen, który zawiera promotor T7 z operatorem lac oraz sekwencję sygnałową PAL LV służącą do kierowania białek do peryplazmy. Bibliotekę endoglukonatazy należy wprowadzić do szczepu e. coli BL 21 DE3 za pomocą szklanych kulek, a następnie wysiać na płytki w celu uzyskania pojedynczych kolonii i inkubować transformaty przez noc w temperaturze 37 °C. Przy użyciu sterylnych wykałaczek należy zaszczepić klony do płytek 96-dołkowych.Studnie głębokich płytek wielodołkowych wypełnić 400 µL pożywki LB uzupełnionej o odpowiednie antybiotyki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc z wytrząsaniem przy 250 RPM. Następnie do nocnych kultur w płytkach 96-dołkowych dodać sterylny glicerol w celu długoterminowego przechowywania w temperaturze -80 °C.Będzie to płytka matrycowa z wykorzystaniem stempla 96-pinowego; należy przenieść hodowle nocne na płytki przesiewowe zawierające IPTG i CMC dla każdej z płytek. Przenieść pięć zestawów hodowli nocnych, opisać i inkubować w temperaturze pokojowej do czasu pojawienia się widocznych kolonii. Kontynuować płukanie płytki wodą destylowaną, aż do całkowitego usunięcia wszystkich śladów kolonii.Wlej taką ilość 0,5% Congo red, aby pokryć wypłukaną płytkę, i inkubuj przez maksymalnie 15 minut w temperaturze pokojowej. Zlej barwnik, dodając obfitą ilość jednomolarnego NaCl i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie wylej NaCl, aby uwidocznić halo degradacji CMC.Za pomocą sterylnego wykałaczki wybierz aktywne enzymy z płyty głównej do dalszej charakterystyki. W tym przykładzie wektory ekspresyjne endoglukonazy wygenerowano w PET 22 B plus pod kontrolą promotora T7 z operatorem lac. Następnie kolonie BL 21 wykazujące ekspresję endoglukonazy przesiewano w celu uzyskania halo degradacji CMC. Po przemyciu i wybarwieniu czerwienią kongową klony na tych płytkach przesiewowych można zazwyczaj zidentyfikować jako nieaktywne, słabo aktywne i wysoce aktywne na podstawie wielkości stref degradacji.W tym przypadku identyfikacja aktywnych enzymów jest niezawodna i powtarzalna. Należy pamiętać o prawidłowym oznakowaniu płytek przesiewowych, aby móc poprawnie zidentyfikować klony pozytywne na płytce matce.

high-throughput-screening-fungal-endoglucanase-activity-escherichia

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe aktywności endoglukanazy grzybowej w Escherichia coli

Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowy screening aktywności celulolitycznej z biblioteki metagenomicznej eksprymowanej w Escherichia coli. Screening opiera się na analizie w roztworze, jest wysoce zautomatyzowany i wykorzystuje chemię jednopojemnikową w mikropłytkach 384-dołkowych, z końcowym odczytem w postaci pomiaru absorbancji.

Wysokoprzepustowy screening aktywności celulazy w procesie biominingu z bibliotek metagenomicznych

Źródło: Kim, H. i in., Wieloenzymowe przesiewowe badanie z użyciem wysokoprzepustowego systemu przesiewowe enzymów genetycznych. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje metodę przesiewania genetycznego do wykrywania ekspresji enzymów z wykorzystaniem metagenomowych bibliotek fosmidów i chromogenicznych substratów. Cytometria przepływowa identyfikuje i izoluje pojedyncze komórki produkujące produkty kolorowe, umożliwiając wysokoprzepustowy selekcję aktywnych komórek ekspresujących enzymy.

Wykrywanie ekspresji docelowych enzymów w genetycznie modyfikowanych komórkach bakteryjnych

W tym filmie demonstrujemy wysokoprzepustowy test do badania przesiewowego enzymów aktywnych węglowodanowo przy użyciu nierozpuszczalnych chromogennych substratów polimerowo-hydrożelowych. Enzym rozkłada te substraty do rozpuszczalnego kolorowego produktu, który można określić ilościowo, mierząc intensywność koloru produktu.

Test przesiewowy enzymów na bazie hydrożelu polimerowego chromogenicznego: wysokoprzepustowa metoda badania przesiewowego enzymów aktywnych węglowodanami przy użyciu substratów syntetycznych

Przedstawiono uproszczone podejście do badań przesiewowych pod kątem ekspresji rekombinowanych białek błonowych u Escherichia coli oparte na fuzji z białkiem zielonej fluorescencji.

Badania przesiewowe białek błonowych Escherichia coli oparte na białkach zielonej fluorescencji

Współekspresja białek jest potężną alternatywą dla rekonstytucji in vitro kompleksów białkowych i jest pomocna w przeprowadzaniu testów biochemicznych i genetycznych in vivo. W tym artykule informujemy o wykorzystaniu koekspresji białek w Escherichia coli do uzyskania kompleksów białkowych i dostrojenia częstotliwości mutacji komórek.

Wieloaspektowe korzyści płynące z koekspresji białek w Escherichia coli

Ta praca przedstawia metodę wysokoprzepustowych badań przesiewowych przy użyciu uniwersalnego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych, który teoretycznie można zastosować do ponad 200 enzymów. W tym przypadku pojedynczy system przesiewowy identyfikuje trzy różne enzymy (lipazę, celulazę i fosfatazę alkaliczną), po prostu zmieniając zastosowany substrat (octan p-nitrofenylu, p-nitrofenylo-β-D-celobiozyd i fosforan fenylu).

Badania przesiewowe wielu enzymów przy użyciu wysokoprzepustowego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych

Opisano wysokoprzepustowy test do badań przesiewowych enzymów. Ten multipleksowany, gotowy do użycia zestaw testowy składa się z wstępnie wybranych substratów Chromogennego Polymeru Hydrogelu (CPH) i złożonych Inierozpuszczalnych wC hromogennych substratach ioB (ICB). Enzymy docelowe to endoenzymy i proteazy rozkładające polisacharydy.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe enzymów rozkładających węglowodany przy użyciu nowatorskich zestawów do oznaczania nierozpuszczalnych substratów chromogennych

Ten protokół opisuje metodologię o wysokiej przepustowości do funkcjonalnego badania przesiewowego pod kątem dziedziczenia opartego na białkach u S. cerevisiae.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku dziedziczenia na podstawie białek u S. cerevisiae

Mikroby jelitowe mogą pozytywnie lub negatywnie wpływać na zdrowie swojego gospodarza poprzez specyficzne lub konserwatywne mechanizmy. Caenorhabditis elegans to wygodna platforma do badań przesiewowych pod kątem takich drobnoustrojów. Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe 48 izolatów bakteryjnych pod kątem wpływu na odporność nicieni na stres, wykorzystywane jako wskaźnik zdrowia robaków.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe izolatów drobnoustrojów mające wpływ na zdrowie Caenorhabditis elegans

Ta praca opisuje protokół dla wielokopijnego badania genetycznego supresorowego u Schizosaccharomyces pombe. To badanie przesiewowe wykorzystuje bibliotekę plazmidów obejmującą cały genom do identyfikacji klonów supresorowych fenotypu utraty funkcji związanego ze zmutowanym szczepem zapytania. Za pomocą tego badania przesiewowego zidentyfikowano nowe supresory genetyczne mutanta zerowego ell1.

Genetyczne badanie przesiewowe do identyfikacji wielokopijnych supresorów u Schizosaccharomyces pombe

Ten protokół przedstawia standardowy przepływ wysokowydajnego przesiewania dla mikroorganizmów przemysłowych. Obejmuje ono konstruowanie biblioteki mutantów poprzez mutagenezę ARTP, przeprowadzanie pozytywnego przesiewania kropel za pomocą zautomatyzowanych mikrofluidów i następnie weryfikację wyników. Niezawodność przepływu została zweryfikowana poprzez przesiewanie wysokowydajnych szczepów B. coagulans.

Przesiewowe badanie wysokowydajne mutantów Bacillus coagulans hiperprodukujących kwas L-mlekowy za pomocą zautomatyzowanej platformy mikrofluidycznej kroplowej

Poznaj metodę wysokoprzepustowego badania aktywności endoglukanazy grzybowej w Escherichia coli z wykorzystaniem barwnika Congo Red. Technika umożliwia szybką ocenę aktywności enzymatycznej bez konieczności puryfikacji białek.

Wysokoprzepustowy screening aktywności grzybowej endoglukanazy w Escherichia coli

Przeglądaj więcej filmów