Opracowanie specyficznych dla typu komórek aptamerów przeciwko gp120 HIV do dostarczania siRNA

Ogólnym celem następujących eksperymentów jest generowanie w vitro aptamerów RNA dla białka HIV-1 gp120 przy użyciu błony nitrocelulozowej. Zostaje to osiągnięte poprzez PCR i następującą po nim transkrypcję in vitro za pomocą polimerazy T7. W celu przygotowania początkowego DNA i losowej biblioteki RNA, w drugim kroku mieszaninę białka docelowego i biblioteki RNA nanosi się na uprzednio zwilżony filtr nitrocelulozowy, co umożliwia wyizolowanie związanych cząsteczek RNA od nie związanych frakcji RNA.

Po 12 cyklach selekcji biblioteka RNA zostaje sklonowana i zsekwencjonowana w celu zidentyfikowania poszczególnych kandydujących aptimerów RNA z biblioteki. Uzyskane wyniki pozwalają zidentyfikować kilka nowych aptimerów o powinowactwie nanomolarnym, na podstawie analiz przesunięcia elektroforetycznego (gel shift assay) i mikroskopii konfokalnej. Główną zaletą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak koraliki (beads) czy metody izolacji oparte na kolumnach, jest ich prostota oraz brak konieczności wstępnego przygotowania białek lub bibliotek, na przykład poprzez unieruchamianie białka na koralikach. Biblioteka RNA do izolacji aptimerów RNA przeciwko HIV GP120 jest przygotowywana z komercyjnie syntetyzowanej biblioteki DNA zawierającej 50 nukleotydów sekwencji randomowych.

Sekwencja biblioteki oligonukleotydów jednoniciowego DNA ma długość 81 nukleotydów. Jak pokazano na tym schemacie, region randomowy jest flankowany przez regiony stałe: A 30 tumor na końcu 5' oraz 16 MA na końcu 3'. Regiony stałe obejmują promotor T7 do transkrypcji in vitro oraz tag 3' do RT-PCR.

Należy przeprowadzić amplifikację biblioteki losowych oligosond jednoniciowego DNA za pomocą PCR, ograniczając liczbę cykli do 10, aby zachować liczność oryginalnej biblioteki DNA. Po reakcjach PCR pulę amplifikowanego dwuniciowego DNA odzyskuje się przy użyciu zestawu do oczyszczania żelowego. Następnie dwuniciowe DNA przekształca się w bibliotekę RNA przy użyciu zestawu cript zgodnie z instrukcjami producenta; w mieszaninie reakcyjnej do transkrypcji CTP oraz UTP zastępuje się dwufluoropirymidyną CTP oraz dwufluoropirymidyną UTP, aby uzyskać RNA odporny na działanie rybonukleaz.

Po zakończeniu reakcji transkrypcji, poddaj reakcje trawieniu enzymem DS one w celu usunięcia matrycy DNA, a następnie oczyść produkt za pomocą żelu z 8% poliakryloamidu i 7 M mocznikiem. Na koniec określ ilość oczyszczonej biblioteki RNA za pomocą spektrofotometrii UV. Przed przystąpieniem do selekcji optimerów przygotuj wymagane bufory i przechowuj je w odpowiednich temperaturach.

Bufor Heaps w temperaturze pokojowej oraz bufory do refoldingu RNA i wiązania RNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Przed rozpoczęciem pierwszego cyklu selekcji, nanieś pulę losowego RNA na uprzednio zwilżony filtr nitrocelulozowy w temperaturze pokojowej na 30 minut, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie z filtrem. Po 30 minutach usuń filtr nitrocelulozowy.

Połącz wstępnie oczyszczoną losową pulę RNA oraz białko HIV one bowel GP one 20 w niskosolowym buforze wiążącym RNA i inkubuj na platformie rotacyjnej w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie przeprowadź reakcję przez wstępnie zwilżony filtr nitrocelulozowy i przemyj 1 mL niskosolowego buforu wiążącego RNA, aby eluować związane RNA z filtra. Usuń membranę nitrocelulozową z uchwytu filtra.

Dodaj 200 µL buforu eluującego do membrany i podgrzewaj w temperaturze 95 °C przez pięć minut. Po elucji RNA z filtra krótko wiruj probówkę, przenieś roztwór RNA do nowej probówki i przeprowadź ekstrakcję fenolo-chloroformową uzyskanego eluatu. Użyj kolumny MicroCon YM 30, aby skoncentrować RNA, a następnie eluuj odzyskane RNA za pomocą 20 µL wody wolnej od RNazy.

Odzyskana pula RNA zostaje następnie poddana odwrotnej transkrypcji i amplifikacji w 15 cyklach PCR. Po oczyszczeniu amplifikowanej puli dwuniciowej, zostaje ona przetranskrybowana w nową pulę RNA, zgodnie z wcześniej opisaną metodą, przed kolejną rundą selekcji. Ponownie zdenaturować pulę RNA w jednokrotnym buforze HBS, podgrzewając do 95 °C przez trzy minuty, a następnie powoli schłodzić do 37 °C.

Kontynuuj inkubację w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Zaadsorbuj zrefoldowany RNA, przenosząc go na filtr nitrocelulozowy na 30 minut przed inkubacją z białkiem HIV bowel GP one 20 w kolejnej rundzie selekcji. Aby pomyślnie uzyskać aptamery o wyższym powinowactwie wiązania, rygor selekcji musi być starannie kontrolowany poprzez dostosowanie warunków selekcji.

Warunki selekcji przedstawiono w tej tabeli. W przypadku rund cellex od pierwszej do czwartej należy inkubować wstępnie oczyszczoną pulę RNA z białkiem docelowym w buforze do wiązania RNA o niskim zasoleniu przez 30 minut. Po czwartej rundzie cellex, w miarę postępu procesu, należy stosować bufor do wiązania RNA o wysokim zasoleniu.

Zmniejsz ilość białka GP120 i zwiększ ilość konkurującego tRNA drożdżowego, aby zwiększyć rygorystyczność selekcji aptamerów w każdym cyklu. Postęp selekcji aptamerów przeciwko GP120 HIV-1 jest monitorowany za pomocą testu wiązania z filtrem. W tym filmie przeanalizowane zostaną 12 pul RNA zebranych po wszystkich cyklach selekcji.

Najpierw usuń inicjującą grupę trifosforanową na końcu 5' poprzez potraktowanie każdej puli RNA fosfatazą z jelit cielęcych (CIP) przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Aby przygotować RNA potraktowane CIP do znakowania za pomocą T4 polinukleotydowej kinazy i P 32 80 p, podgrzej próbki do 95 °C przez pięć minut, a następnie schłódź na lodzie. Znakowanie RNA przeprowadza się w pomieszczeniu grzewczym przeznaczonym do eksperymentów z użyciem izotopów promieniotwórczych, dodając bufor PNK, T4 polinukleotydową kinazę, 1 µL gamma P 32 ATP oraz wodę do objętości 20 µL. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez 30 minut.

Po 30 minutach dodaj 20 µL wody do każdej reakcji i oczyść za pomocą kolumny G 50. W rezultacie należy uzyskać 40 µL znakowanego RNA o stężeniu końcowym 250 nM; każdą pulę znakowanego RNA w jednokrotny bufor HBS podgrzej do 95 °C przez trzy minuty. Następnie pozwól próbkom ostygnąć do 37 °C, co zajmie od 30 do 40 minut.

Kontynuuj inkubację w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Po renaturacji puli RNA przeprowadź reakcję wiązania w objętości 100 µL. Połącz znakowaną pulę RNA z białkiem GP one 20 oraz dziesiękrotnym nadmiarem molowym niespecyficznego konkurującego tRNA w wysokosolnym buforze do wiązania RNA i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Po upływie 30 minut oddziel 50 µL reakcji wiązania za pomocą uprzednio zwilżonego filtra z nitrocelulozy. Następnie przemyj filtr dwoma mililitrami buforu wiążącego i zmierz aktywność promieniotwórczą zatrzymaną na filtrze za pomocą wielofunkcyjnego licznika scyntylacyjnego w celu uzyskania pomiaru kontrolnego wejścia. Pozostałe 50 µL reakcji wiązania jednocześnie wykorzystano do analizy testu wiązania puli RNA po każdym cyklu selekcji za pomocą testu wiązania na filtrze z konkurencyjnym tRNA, aby monitorować postępy HIV-1, GP120.

Aktywności wiązania w procesie selekcji Optima obliczono jako procent RNA wejściowego zatrzymanego na filtrze w formie kompleksu białkowo-RNA, co przedstawiono na powyższym schemacie. Początkowa pula RNA wykazuje zatrzymanie jedynie 0,1% RNA wejściowego na membranie. Jednakże po dziewięciu rundach selekcji, dziewiąta biblioteka RNA wykazuje związanie 9,72% RNA wejściowego.

Mimo przeprowadzenia dodatkowych rund selekcji, nie zaobserwowano dalszego wzbogacenia, co sugeruje osiągnięcie maksymalnego wiązania puli RNA. Aktywność wiążącą pul RNA potwierdzono następnie za pomocą testów przesunięcia elektroforetycznego (gel shift assays). Wyniki te wykazują, że w pulach RNA sukcesywnie wzbogacano ligandy o wysokiej specyficzności wiązania względem białka docelowego.

W niniejszym przykładzie 12. pula RNA wykazała najwyższą aktywność wiązania, ponieważ maksymalne wiązanie puli RNA osiągnięto po 12. rundzie selekcji; ta pula RNA została poddana odwrotnej transkrypcji do cDNA, które następnie powielono metodą PCR. Produkt PCR został następnie oczyszczony i sklonowany do wektora klonującego TA, a po wyrównaniu 140 klonów przeprowadzono ich sekwencjonowanie. Zidentyfikowano sześć grup optymalnych aptamerów anty-GP120.

W niniejszej tabeli wskazano jedynie losowe sekwencje regionów rdzeniowych Aptima. Około 40% klonów zawiera sekwencję konserwatywną. Do dalszej charakterystyki wybrano jedną reprezentatywną sekwencję z każdej grupy ze względu na ich względną liczność w obrębie danej grupy; za pomocą analizy przesunięcia mobilności w natywnym żelu obliczono stałe dysocjacji KD tych reprezentatywnych aptamerów, na przykład A1.

Najlepsze z przeciwciał (abers) wykazuje pozorną wartość KD wynoszącą 52 nanomolar. Jak tu pokazano, wybrane przeciwciała mogą selektywnie wiązać się z docelowym białkiem otoczki HIV-1 gp120, ale nie z białkiem HIV-GP120 CM. Do testowania wiązania i internalizacji wybranych optymalnych przeciwciał anty-GP120 wykorzystano komórki CHO G160 stabilnie eksponujące glikoproteinę otoczki HIV GP160.

Komórki te nie przetwarzają białka GP160 do form GP120 i G41, ponieważ brakuje im kodowanych przez gen gag proteaz niezbędnych do przetwarzania otoczki. Analiza cytometryczna z przepływem wykazuje, że aptamery znakowane S3 wiążą się specyficznie z komórkami CHO GP160, ale nie z kontrolnymi komórkami CHO EE, które nie wykazują ekspresji GP160. Ponadto konfokalna mikroskopia Z-stack w czasie rzeczywistym na żywych komórkach wskazuje, że po dwóch godzinach inkubacji aptamery znakowane S3 są selektywnie internalizowane przez komórki CHO GP160, a nie przez kontrolne komórki CHO EE. Zaobserwowano również, że aptamery agregowały w cytoplazmie, co sugeruje, że aptamer GP120 może wnikać do komórek poprzez endocytozę zależną od receptorów.

Na koniec, po obejrzeniu tego filmu, powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wykorzystać pomiary terenowe do izolacji RNA Abers.