Name: Opracowanie specyficznych dla typu komórkowego aptamerów anty-HIV gp120 do dostarczania siRNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Poznaj metodę SELEX na filtrze nitrocelulozowym do izolacji wysokoafinicznych aptamerów RNA przeciwko białku gp120 HIV-1 oraz tworzenia chimerycznych cząsteczek aptamer-siRNA dla celowanej terapii antywirusowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Britta Hoehn, Guihua Sun, Harris Soifer oraz Lisa Scherer za pomocne dyskusje. Niniejsza praca została sfinansowana z grantów National Institutes of Health AI29329 i HL07470 przyznanych J.J.R. Poniższe odczynniki zostały pozyskane poprzez NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: linia komórkowa CHO-EE i CHO-gp160; wektor pNL4-3 luc; HIV-1BaL gp120 z DAIDS, NIAID.

<ol><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Robertson, D. L., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+in+vitro+of+an+RNA+enzyme+that+specifically+cleaves+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA.</a> Nature. 344, 467-468 (1990).</li>
<li>Fitzwater, T., Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SELEX+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">A SELEX primer.</a> Methods Enzymol. 267, 275-301 (1996).</li>
<li>Weiss, C. D., White, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+stable+Chinese+hamster+ovary+cells+expressing+wild-type%2C+secreted%2C+and+glycosylphosphatidylinositol-anchored+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of stable Chinese hamster ovary cells expressing wild-type, secreted, and glycosylphosphatidylinositol-anchored human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein.</a> J Virol. 67, 7060-706 (1993).</li>
<li>Vodicka, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indicator+cell+lines+for+detection+of+primary+strains+of+human+and+simian+immunodeficiency+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses.</a> Virology. 233, 193-198> (1997).</li>
<li>Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection%2C+characterization+and+application+of+new+RNA+HIV+gp+120+aptamers+for+facile+delivery+of+Dicer+substrate+siRNAs+into+HIV+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection, characterization and application of new RNA HIV gp 120 aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs into HIV infected cells.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li>
<li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+biology+of+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The chemical biology of aptamers.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48, 2672-2689 (2009).</li>
<li>Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+aptamers+and+aptazymes+in+biotechnology%2C+diagnostics%2C+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy.</a> Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).</li>
<li>Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+mediated+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Aptamer mediated siRNA delivery.</a> Nucleic Acids Res. 34, e73-e73 (2006).</li>
<li>McNamara, J. O., 2nd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+delivery+of+siRNAs+with+aptamer-siRNA+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras.</a> Nat Biotechnol. 24, 1005-1015 (2006).</li>
<li>Dassie, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+optimized+aptamer-siRNA+chimeras+promotes+regression+of+PSMA-expressing+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors.</a> Nat Biotechnol. 27, 839-849 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+cell-internalizing+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers.</a> Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dual+inhibitory+function+aptamer-siRNA+delivery+system+for+HIV-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy.</a> Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).</li>
</ol>

J. R i J. Z. posiadają oczekiwany patent na „System dostarczania aptameru-siRNA specyficznego dla typu komórek w terapii HIV-1”. USPTO, nr 12/328994, data publikacji: 11 czerwca 2009 r.

Aptamery to ewoluowane in vitro kwasy nukleinowe, które przyjmują specyficzne i stabilne kształty trójwymiarowe, zapewniając tym samym bardzo specyficzne i silne wiązanie z cząsteczkami docelowymi8. Niskonanomolarna powinowactwo wiązania i wyjątkowa specyficzność aptamerów względem ich celów sprawiają, że są one wszechstronnymi narzędziami w diagnostyce, obrazowaniu in vivo oraz terapeutyce9. Dzięki rozwojowi technologii aptamerów w ukiernicowanym dostarczaniu siRNA, możliwe jest o...

<table><tbody><tr><td>filtr membranowy MF-Millipore</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWP01300</td><td>rozmiar porów 0,45 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>uchwyt do filtrów Swinnex</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0001300</td><td>średnica 13 mm</td></tr><tr><td>zestaw do ekstrakcji żelowej QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>oczyszczanie DNA</td></tr><tr><td>kolumna Microcon YM-30</td><td>EMD Millipore</td><td>42410</td><td>koncentracja RNA</td></tr><tr><td>kolumna Bio-spin 30</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6250</td><td>oczyszczanie RNA</td></tr><tr><td>polimeraza DNA Taq PCR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1806</td><td></td></tr><tr><td>system ThermoScript RT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>11146-024</td><td></td></tr><tr><td>zestaw do transkrypcji T7 DuraScribe</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>DS010925</td><td></td></tr><tr><td>dNTP do PCR</td><td>Roche Group</td><td>1 581 295</td><td></td></tr><tr><td>kwas rybonukleowy, transfer z E.coli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753</td><td>konkurent tRNA</td></tr><tr><td>białko HIV-1&lt;sub&gt;Ba-L&lt;/sub&gt; gp120</td><td>National Institutes of Health</td><td>4961</td><td>białko docelowe</td></tr><tr><td>zestaw do znakowania siRNA Silencer – Cy3</td><td>Ambion</td><td>1632</td><td></td></tr><tr><td>roztwór kwasowego fenolu/chloroformu 5/1 (pH 4,5)</td><td>Ambion</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>roztwór chloroformu/izopropanolu 24/1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>fosfataza jelitowa cielęca (CIP)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290L</td><td></td></tr><tr><td>polinukleotydowa kinaza T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>glikogen</td><td>Roche Group</td><td>10 901 393 001</td><td>wytrącanie RNA</td></tr><tr><td>Gamma-P&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;-ATP</td><td>MP Biomedicals</td><td>013502002</td><td>radioaktywność</td></tr><tr><td>40% AccuGel 19:1</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-850</td><td></td></tr><tr><td>10xTBE</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-860</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N,N&amp;rsquo;-tetrametylのエチレンジアミン (TMEMD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>persiarczan amonu (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>L-metioninosulfoxymina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5379-250 mg</td><td></td></tr><tr><td>pożywka RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>roztwór wodorowęglanu sodu, 7,5% m/v</td><td>Invitrogen</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>podstawkowa pożywka niezbędna (MEM) (10')</td><td>Invitrogen</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>niezbędne aminokwasy MEM (100')</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>zestaw do klonowania TA z pCR 2.1</td><td>Invitrogen</td><td>K2040-01</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie specyficznych dla typu komórek aptamerów przeciwko gp120 hiv do dostarczania sirna

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

Globalna epidemia zakażeń HIV stworzyła pilną potrzebę opracowania nowych klas leków antyretrowirusowych. Wykorzystuje się silną zdolność małych interferujących (si)RNA do hamowania ekspresji komplementarnych transkryptów RNA jako nową klasę terapeutyków w leczeniu wielu chorób, w tym HIV. Wiele wcześniejszych doniesień wykazało, że nowatorskie strategie terapeutyczne przeciwko HIV/AIDS oparte na RNAi wykazują znaczny potencjał; jednak kluczową przeszkodą w skutecznym zastosowaniu terapeutycznym i translacji klinicznej siRNAs jest efektywne dostarczanie. Biorąc pod uwagę bezpieczeństwo i skuteczność terapii opartych na RNAi, szczególnie pożądane jest opracowanie metody celowanego wewnątrzkomórkowego dostarczania siRNA do konkretnych populacji komórek lub tkanek. Białko HIV-1 gp120, glikoproteina otoczki na powierzchni HIV-1, odgrywa istotną rolę w wnikaniu wirusa do komórek CD4. Interakcja gp120 i CD4, która wyzwala wniknięcie HIV-1 i inicjuje fuzję komórkową, została potwierdzona jako klinicznie istotna strategia przeciwwirusowa w poszukiwaniu nowych leków.
W niniejszej pracy omawiamy w pierwszej kolejności wybór i identyfikację zmodyfikowanych 2'-F aptamerów RNA przeciwko białku gp120 HIV. Wykorzystując konwencjonalną metodę SELEX z filtrem nitrocelulozowym, wyizolowano kilka nowych aptamerów o powinowactwie nanomolarnym z biblioteki 50 losowych nukleotydów nt RNA. Aby skutecznie uzyskać wiążące się gatunki o wyższym powinowactwie, rygorystyczność selekcji była starannie kontrolowana poprzez dostosowanie warunków. Wybrane aptamery mogą specyficznie wiązać się i być szybko internalizowane do komórek wykazujących ekspresję białka otoczki HIV-1. Ponadto same aptamery mogą neutralizować zakaźność HIV-1. W oparciu o najlepszy aptamer A-1 stworzyliśmy również nową chimerę aptamer-siRNA o podwójnej funkcji inhibicyjnej przeciwko gp120, w której zarówno część aptamerowa, jak i część siRNA wykazują silną aktywność przeciwko HIV. Dalej wykorzystujemy chimery aptamer-siRNA gp120 do specyficznego dla typu komórek dostarczania siRNA do zainfekowanych komórek HIV-1. Ta chimera o podwójnej funkcji wykazuje znaczny potencjał w łączeniu różnych terapeutycznych czynników kwasów nukleinowych (aptameru i siRNA) w celu hamowania infekcji HIV-1, co czyni chimery aptamer-siRNA atrakcyjnymi kandydatami terapeutycznymi dla pacjentów, u których wysokoaktywna terapia antyretrowirusowa (HAART) nie przynosi efektów.

Kilka aptamerów 2’-Fluoro RNA przeciwko HIV-1Ba-L gp120 o powinowactwie nanomolowym zostało wyizolowanych z biblioteki RNA za pomocą procedury in vitro SELEX. Stworzono nową chimerę aptamer-siRNA o podwójnej funkcji hamującej przeciwko gp120, która wykazuje znaczny potencjał w systemowej terapii przeciw HIV.

Opracowanie specyficznych dla typu komórek aptamerów przeciwko gp120 HIV do dostarczania siRNA

Globalna epidemia zakażeń wirusem HIV stworzyła pilną potrzebę opracowania nowych klas leków antyretrowirusowych. Silna zdolność małych interferujących...

Ogólnym celem następujących eksperymentów jest generowanie w vitro aptamerów RNA dla białka HIV-1 gp120 przy użyciu błony nitrocelulozowej. Zostaje to osiągnięte poprzez PCR i następującą po nim transkrypcję in vitro za pomocą polimerazy T7. W celu przygotowania początkowego DNA i losowej biblioteki RNA, w drugim kroku mieszaninę białka docelowego i biblioteki RNA nanosi się na uprzednio zwilżony filtr nitrocelulozowy, co umożliwia wyizolowanie związanych cząsteczek RNA od nie związanych frakcji RNA.Po 12 cyklach selekcji biblioteka RNA zostaje sklonowana i zsekwencjonowana w celu zidentyfikowania poszczególnych kandydujących aptimerów RNA z biblioteki. Uzyskane wyniki pozwalają zidentyfikować kilka nowych aptimerów o powinowactwie nanomolarnym, na podstawie analiz przesunięcia elektroforetycznego (gel shift assay) i mikroskopii konfokalnej. Główną zaletą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak koraliki (beads) czy metody izolacji oparte na kolumnach, jest ich prostota oraz brak konieczności wstępnego przygotowania białek lub bibliotek, na przykład poprzez unieruchamianie białka na koralikach. Biblioteka RNA do izolacji aptimerów RNA przeciwko HIV GP120 jest przygotowywana z komercyjnie syntetyzowanej biblioteki DNA zawierającej 50 nukleotydów sekwencji randomowych.Sekwencja biblioteki oligonukleotydów jednoniciowego DNA ma długość 81 nukleotydów. Jak pokazano na tym schemacie, region randomowy jest flankowany przez regiony stałe: A 30 tumor na końcu 5' oraz 16 MA na końcu 3'. Regiony stałe obejmują promotor T7 do transkrypcji in vitro oraz tag 3' do RT-PCR.Należy przeprowadzić amplifikację biblioteki losowych oligosond jednoniciowego DNA za pomocą PCR, ograniczając liczbę cykli do 10, aby zachować liczność oryginalnej biblioteki DNA. Po reakcjach PCR pulę amplifikowanego dwuniciowego DNA odzyskuje się przy użyciu zestawu do oczyszczania żelowego. Następnie dwuniciowe DNA przekształca się w bibliotekę RNA przy użyciu zestawu cript zgodnie z instrukcjami producenta; w mieszaninie reakcyjnej do transkrypcji CTP oraz UTP zastępuje się dwufluoropirymidyną CTP oraz dwufluoropirymidyną UTP, aby uzyskać RNA odporny na działanie rybonukleaz.Po zakończeniu reakcji transkrypcji, poddaj reakcje trawieniu enzymem DS one w celu usunięcia matrycy DNA, a następnie oczyść produkt za pomocą żelu z 8% poliakryloamidu i 7 M mocznikiem. Na koniec określ ilość oczyszczonej biblioteki RNA za pomocą spektrofotometrii UV. Przed przystąpieniem do selekcji optimerów przygotuj wymagane bufory i przechowuj je w odpowiednich temperaturach.Bufor Heaps w temperaturze pokojowej oraz bufory do refoldingu RNA i wiązania RNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Przed rozpoczęciem pierwszego cyklu selekcji, nanieś pulę losowego RNA na uprzednio zwilżony filtr nitrocelulozowy w temperaturze pokojowej na 30 minut, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie z filtrem. Po 30 minutach usuń filtr nitrocelulozowy.Połącz wstępnie oczyszczoną losową pulę RNA oraz białko HIV one bowel GP one 20 w niskosolowym buforze wiążącym RNA i inkubuj na platformie rotacyjnej w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie przeprowadź reakcję przez wstępnie zwilżony filtr nitrocelulozowy i przemyj 1 mL niskosolowego buforu wiążącego RNA, aby eluować związane RNA z filtra. Usuń membranę nitrocelulozową z uchwytu filtra.Dodaj 200 µL buforu eluującego do membrany i podgrzewaj w temperaturze 95 °C przez pięć minut. Po elucji RNA z filtra krótko wiruj probówkę, przenieś roztwór RNA do nowej probówki i przeprowadź ekstrakcję fenolo-chloroformową uzyskanego eluatu. Użyj kolumny MicroCon YM 30, aby skoncentrować RNA, a następnie eluuj odzyskane RNA za pomocą 20 µL wody wolnej od RNazy.Odzyskana pula RNA zostaje następnie poddana odwrotnej transkrypcji i amplifikacji w 15 cyklach PCR. Po oczyszczeniu amplifikowanej puli dwuniciowej, zostaje ona przetranskrybowana w nową pulę RNA, zgodnie z wcześniej opisaną metodą, przed kolejną rundą selekcji. Ponownie zdenaturować pulę RNA w jednokrotnym buforze HBS, podgrzewając do 95 °C przez trzy minuty, a następnie powoli schłodzić do 37 °C.Kontynuuj inkubację w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Zaadsorbuj zrefoldowany RNA, przenosząc go na filtr nitrocelulozowy na 30 minut przed inkubacją z białkiem HIV bowel GP one 20 w kolejnej rundzie selekcji. Aby pomyślnie uzyskać aptamery o wyższym powinowactwie wiązania, rygor selekcji musi być starannie kontrolowany poprzez dostosowanie warunków selekcji.Warunki selekcji przedstawiono w tej tabeli. W przypadku rund cellex od pierwszej do czwartej należy inkubować wstępnie oczyszczoną pulę RNA z białkiem docelowym w buforze do wiązania RNA o niskim zasoleniu przez 30 minut. Po czwartej rundzie cellex, w miarę postępu procesu, należy stosować bufor do wiązania RNA o wysokim zasoleniu.Zmniejsz ilość białka GP120 i zwiększ ilość konkurującego tRNA drożdżowego, aby zwiększyć rygorystyczność selekcji aptamerów w każdym cyklu. Postęp selekcji aptamerów przeciwko GP120 HIV-1 jest monitorowany za pomocą testu wiązania z filtrem. W tym filmie przeanalizowane zostaną 12 pul RNA zebranych po wszystkich cyklach selekcji.Najpierw usuń inicjującą grupę trifosforanową na końcu 5' poprzez potraktowanie każdej puli RNA fosfatazą z jelit cielęcych (CIP) przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Aby przygotować RNA potraktowane CIP do znakowania za pomocą T4 polinukleotydowej kinazy i P 32 80 p, podgrzej próbki do 95 °C przez pięć minut, a następnie schłódź na lodzie. Znakowanie RNA przeprowadza się w pomieszczeniu grzewczym przeznaczonym do eksperymentów z użyciem izotopów promieniotwórczych, dodając bufor PNK, T4 polinukleotydową kinazę, 1 µL gamma P 32 ATP oraz wodę do objętości 20 µL. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez 30 minut.Po 30 minutach dodaj 20 µL wody do każdej reakcji i oczyść za pomocą kolumny G 50. W rezultacie należy uzyskać 40 µL znakowanego RNA o stężeniu końcowym 250 nM; każdą pulę znakowanego RNA w jednokrotny bufor HBS podgrzej do 95 °C przez trzy minuty. Następnie pozwól próbkom ostygnąć do 37 °C, co zajmie od 30 do 40 minut.Kontynuuj inkubację w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Po renaturacji puli RNA przeprowadź reakcję wiązania w objętości 100 µL. Połącz znakowaną pulę RNA z białkiem GP one 20 oraz dziesiękrotnym nadmiarem molowym niespecyficznego konkurującego tRNA w wysokosolnym buforze do wiązania RNA i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Po upływie 30 minut oddziel 50 µL reakcji wiązania za pomocą uprzednio zwilżonego filtra z nitrocelulozy. Następnie przemyj filtr dwoma mililitrami buforu wiążącego i zmierz aktywność promieniotwórczą zatrzymaną na filtrze za pomocą wielofunkcyjnego licznika scyntylacyjnego w celu uzyskania pomiaru kontrolnego wejścia. Pozostałe 50 µL reakcji wiązania jednocześnie wykorzystano do analizy testu wiązania puli RNA po każdym cyklu selekcji za pomocą testu wiązania na filtrze z konkurencyjnym tRNA, aby monitorować postępy HIV-1, GP120.Aktywności wiązania w procesie selekcji Optima obliczono jako procent RNA wejściowego zatrzymanego na filtrze w formie kompleksu białkowo-RNA, co przedstawiono na powyższym schemacie. Początkowa pula RNA wykazuje zatrzymanie jedynie 0,1% RNA wejściowego na membranie. Jednakże po dziewięciu rundach selekcji, dziewiąta biblioteka RNA wykazuje związanie 9,72% RNA wejściowego.Mimo przeprowadzenia dodatkowych rund selekcji, nie zaobserwowano dalszego wzbogacenia, co sugeruje osiągnięcie maksymalnego wiązania puli RNA. Aktywność wiążącą pul RNA potwierdzono następnie za pomocą testów przesunięcia elektroforetycznego (gel shift assays). Wyniki te wykazują, że w pulach RNA sukcesywnie wzbogacano ligandy o wysokiej specyficzności wiązania względem białka docelowego.W niniejszym przykładzie 12. pula RNA wykazała najwyższą aktywność wiązania, ponieważ maksymalne wiązanie puli RNA osiągnięto po 12. rundzie selekcji; ta pula RNA została poddana odwrotnej transkrypcji do cDNA, które następnie powielono metodą PCR. Produkt PCR został następnie oczyszczony i sklonowany do wektora klonującego TA, a po wyrównaniu 140 klonów przeprowadzono ich sekwencjonowanie. Zidentyfikowano sześć grup optymalnych aptamerów anty-GP120.W niniejszej tabeli wskazano jedynie losowe sekwencje regionów rdzeniowych Aptima. Około 40% klonów zawiera sekwencję konserwatywną. Do dalszej charakterystyki wybrano jedną reprezentatywną sekwencję z każdej grupy ze względu na ich względną liczność w obrębie danej grupy; za pomocą analizy przesunięcia mobilności w natywnym żelu obliczono stałe dysocjacji KD tych reprezentatywnych aptamerów, na przykład A1.Najlepsze z przeciwciał (abers) wykazuje pozorną wartość KD wynoszącą 52 nanomolar. Jak tu pokazano, wybrane przeciwciała mogą selektywnie wiązać się z docelowym białkiem otoczki HIV-1 gp120, ale nie z białkiem HIV-GP120 CM. Do testowania wiązania i internalizacji wybranych optymalnych przeciwciał anty-GP120 wykorzystano komórki CHO G160 stabilnie eksponujące glikoproteinę otoczki HIV GP160.Komórki te nie przetwarzają białka GP160 do form GP120 i G41, ponieważ brakuje im kodowanych przez gen gag proteaz niezbędnych do przetwarzania otoczki. Analiza cytometryczna z przepływem wykazuje, że aptamery znakowane S3 wiążą się specyficznie z komórkami CHO GP160, ale nie z kontrolnymi komórkami CHO EE, które nie wykazują ekspresji GP160. Ponadto konfokalna mikroskopia Z-stack w czasie rzeczywistym na żywych komórkach wskazuje, że po dwóch godzinach inkubacji aptamery znakowane S3 są selektywnie internalizowane przez komórki CHO GP160, a nie przez kontrolne komórki CHO EE. Zaobserwowano również, że aptamery agregowały w cytoplazmie, co sugeruje, że aptamer GP120 może wnikać do komórek poprzez endocytozę zależną od receptorów.Na koniec, po obejrzeniu tego filmu, powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wykorzystać pomiary terenowe do izolacji RNA Abers.

development-cell-type-specific-anti-hiv-gp120-aptamers-for-sirna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opracowanie specyficznych dla typu komórki aptamerów przeciwko HIV gp120 do dostarczania siRNA

Zrozumienie konformacji antygenów powierzchniowych wirusa jest niezbędne do oceny neutralizacji przeciwciał i kierowania projektem skutecznych immunogenów szczepionkowych. W tym miejscu opisujemy komórkowy test ELISA, który umożliwia badanie rozpoznawania trimerycznego HIV-1 Env ulegającego ekspresji na powierzchni transfekowanych komórek przez specyficzne przeciwciała anty-Env.

Ocena konformacyjna glikoprotein otoczki trymerowej HIV-1 przy użyciu komórkowego testu ELISA

Tutaj prezentujemy protokół do generowania wektora Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 o nazwie Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 poprzez wykorzystanie strategii inkorporacji antygenu kapsydu. Wykazano, że wektor ten wykazuje przydatność jakościową, zdolność do ucieczki z surowic Ad5-dodatnich in vitro oraz antygenowość i immunogenność w stosunku do włączonych antygenów.

Wykorzystanie strategii inkorporacji kapsydu antygenu do opracowania metod szczepień z wektorem 5 serowirusa

Ten protokół opisuje metody konstruowania humanizowanego modelu myszy szpiku kostnego/wątroby/grasicy z opartą na komórkach macierzystych odpornością na zakażenie wirusem HIV.

Zmodyfikowana odporność na zakażenie wirusem HIV oparta na komórkach macierzystych w humanizowanym modelu myszy

Opisano metody oceny skuteczności i toksyczności cząsteczek RNA ukierunkowanych na etapy postintegracyjne cyklu replikacji HIV-1. Metody te są przydatne do badań przesiewowych nowych cząsteczek i optymalizacji formatu istniejących.

Ocena skuteczności i toksyczności RNA ukierunkowanych na produkcję HIV-1 do stosowania w terapii genowej lub lekowej

Modułowe podejście do syntezy N-glikanów do dołączania do szkiełka pokrytego tlenkiem glinu (ACG) jako mikromatrycy glikanowej zostało opracowane i zademonstrowano jego zastosowanie do profilowania przeciwciała neutralizującego wirusa HIV.

Chemoenzymatyczna synteza N-glikanów do tworzenia macierzy i profilowania przeciwciał HIV

Opisujemy test oparty na komórkach, który informuje o fuzji HIV-1 poprzez ekspresję białka zielonej fluorescencji wykrywalnego za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii fluorescencyjnej. Może być stosowany do testowania inhibitorów wnikania wirusa (szczególnie na etapie fuzji) w systemach infekcji bezkomórkowych i międzykomórkowych.

Wysokoprzepustowy test fuzji błony wirusowej aktywowanej Cre-Lox w celu identyfikacji inhibitorów fuzji błony wirusowej HIV-1

Metoda BSelex do identyfikacji i odzyskiwania pojedynczych przeciwciał specyficznych dla antygenu z komórek jednojądrzastych ludzkiej krwi obwodowej łączy cytometrię przepływową z PCR pojedynczych komórek i klonowaniem.

Metoda przesiewowa pojedynczych komórek w celu selekcji i odzyskiwania przeciwciał o pożądanej swoistości ze wzbogaconych populacji komórek B ludzkiej pamięci

Szczegółowa metoda jest tutaj opisana jako oczyszczanie, ponowne fałdowanie i charakterystyka samoorganizujących się nanocząstek białkowych (SAPN) do wykorzystania w opracowywaniu szczepionek.

Wytwarzanie samoorganizujących się nanocząstek białkowych z ekspresją E. coli do szczepionek wymagających prezentacji epitopów trymerycznych

Wzór glikozylacji przeciwciała determinuje jego skuteczność kliniczną, dlatego przemysłowe i akademickie wysiłki zmierzające do kontroli glikozylacji trwają. Ponieważ typowe kampanie glikoinżynieryjne są czasochłonne i pracochłonne, przydatne byłoby opracowanie szybkiego protokołu do scharakteryzowania wpływu genów glikozylacji za pomocą przejściowego wyciszania.

Szybka glikoinżynieria przeciwciał w komórkach jajnika chomika chińskiego

Udostępniamy protokół, który może być ogólnie stosowany do wybranych aptamerów, które wiążą się tylko z wirusami zakaźnymi, a nie z wirusami, które stały się niezakaźne za pomocą metody dezynfekcji lub z innymi podobnymi wirusami. Otwiera to możliwość określenia statusu zakaźności w testach przenośnych i szybkich.

Selekcja aptamerów in vitro w celu odróżnienia wirusów zakaźnych od niezakaźnych

Poznaj metodę SELEX na filtrze nitrocelulozowym do izolacji wysokoafinicznych aptamerów RNA przeciwko białku gp120 HIV-1 oraz tworzenia chimerycznych cząsteczek aptamer-siRNA dla celowanej terapii antywirusowej.

Opracowanie specyficznych dla typu komórek aptamerów przeciwko gp120 HIV do dostarczania siRNA

Przeglądaj więcej filmów