Name: Opracowanie specyficznych dla typu komórkowego aptamerów anty-HIV gp120 do dostarczania siRNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Poznaj metodę SELEX na filtrze nitrocelulozowym do izolacji wysokoafinicznych aptamerów RNA przeciwko białku gp120 HIV-1 oraz tworzenia chimerycznych cząsteczek aptamer-siRNA dla celowanej terapii antywirusowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Britta Hoehn, Guihua Sun, Harris Soifer oraz Lisa Scherer za pomocne dyskusje. Niniejsza praca została sfinansowana z grantów National Institutes of Health AI29329 i HL07470 przyznanych J.J.R. Poniższe odczynniki zostały pozyskane poprzez NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: linia komórkowa CHO-EE i CHO-gp160; wektor pNL4-3 luc; HIV-1BaL gp120 z DAIDS, NIAID.

<ol><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Robertson, D. L., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+in+vitro+of+an+RNA+enzyme+that+specifically+cleaves+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA.</a> Nature. 344, 467-468 (1990).</li>
<li>Fitzwater, T., Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SELEX+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">A SELEX primer.</a> Methods Enzymol. 267, 275-301 (1996).</li>
<li>Weiss, C. D., White, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+stable+Chinese+hamster+ovary+cells+expressing+wild-type%2C+secreted%2C+and+glycosylphosphatidylinositol-anchored+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of stable Chinese hamster ovary cells expressing wild-type, secreted, and glycosylphosphatidylinositol-anchored human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein.</a> J Virol. 67, 7060-706 (1993).</li>
<li>Vodicka, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indicator+cell+lines+for+detection+of+primary+strains+of+human+and+simian+immunodeficiency+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses.</a> Virology. 233, 193-198> (1997).</li>
<li>Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection%2C+characterization+and+application+of+new+RNA+HIV+gp+120+aptamers+for+facile+delivery+of+Dicer+substrate+siRNAs+into+HIV+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection, characterization and application of new RNA HIV gp 120 aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs into HIV infected cells.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li>
<li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+biology+of+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The chemical biology of aptamers.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48, 2672-2689 (2009).</li>
<li>Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+aptamers+and+aptazymes+in+biotechnology%2C+diagnostics%2C+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy.</a> Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).</li>
<li>Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+mediated+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Aptamer mediated siRNA delivery.</a> Nucleic Acids Res. 34, e73-e73 (2006).</li>
<li>McNamara, J. O., 2nd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+delivery+of+siRNAs+with+aptamer-siRNA+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras.</a> Nat Biotechnol. 24, 1005-1015 (2006).</li>
<li>Dassie, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+optimized+aptamer-siRNA+chimeras+promotes+regression+of+PSMA-expressing+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors.</a> Nat Biotechnol. 27, 839-849 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+cell-internalizing+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers.</a> Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dual+inhibitory+function+aptamer-siRNA+delivery+system+for+HIV-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy.</a> Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).</li>
</ol>

J. R i J. Z. posiadają oczekiwany patent na „System dostarczania aptameru-siRNA specyficznego dla typu komórek w terapii HIV-1”. USPTO, nr 12/328994, data publikacji: 11 czerwca 2009 r.

Aptamery to ewoluowane in vitro kwasy nukleinowe, które przyjmują specyficzne i stabilne kształty trójwymiarowe, zapewniając tym samym bardzo specyficzne i silne wiązanie z cząsteczkami docelowymi8. Niskonanomolarna powinowactwo wiązania i wyjątkowa specyficzność aptamerów względem ich celów sprawiają, że są one wszechstronnymi narzędziami w diagnostyce, obrazowaniu in vivo oraz terapeutyce9. Dzięki rozwojowi technologii aptamerów w ukiernicowanym dostarczaniu siRNA, możliwe jest o...

<table><tbody><tr><td>filtr membranowy MF-Millipore</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWP01300</td><td>rozmiar porów 0,45 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>uchwyt do filtrów Swinnex</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0001300</td><td>średnica 13 mm</td></tr><tr><td>zestaw do ekstrakcji żelowej QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>oczyszczanie DNA</td></tr><tr><td>kolumna Microcon YM-30</td><td>EMD Millipore</td><td>42410</td><td>koncentracja RNA</td></tr><tr><td>kolumna Bio-spin 30</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6250</td><td>oczyszczanie RNA</td></tr><tr><td>polimeraza DNA Taq PCR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1806</td><td></td></tr><tr><td>system ThermoScript RT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>11146-024</td><td></td></tr><tr><td>zestaw do transkrypcji T7 DuraScribe</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>DS010925</td><td></td></tr><tr><td>dNTP do PCR</td><td>Roche Group</td><td>1 581 295</td><td></td></tr><tr><td>kwas rybonukleowy, transfer z E.coli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753</td><td>konkurent tRNA</td></tr><tr><td>białko HIV-1&lt;sub&gt;Ba-L&lt;/sub&gt; gp120</td><td>National Institutes of Health</td><td>4961</td><td>białko docelowe</td></tr><tr><td>zestaw do znakowania siRNA Silencer – Cy3</td><td>Ambion</td><td>1632</td><td></td></tr><tr><td>roztwór kwasowego fenolu/chloroformu 5/1 (pH 4,5)</td><td>Ambion</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>roztwór chloroformu/izopropanolu 24/1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>fosfataza jelitowa cielęca (CIP)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290L</td><td></td></tr><tr><td>polinukleotydowa kinaza T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>glikogen</td><td>Roche Group</td><td>10 901 393 001</td><td>wytrącanie RNA</td></tr><tr><td>Gamma-P&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;-ATP</td><td>MP Biomedicals</td><td>013502002</td><td>radioaktywność</td></tr><tr><td>40% AccuGel 19:1</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-850</td><td></td></tr><tr><td>10xTBE</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-860</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N,N&amp;rsquo;-tetrametylのエチレンジアミン (TMEMD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>persiarczan amonu (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>L-metioninosulfoxymina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5379-250 mg</td><td></td></tr><tr><td>pożywka RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>roztwór wodorowęglanu sodu, 7,5% m/v</td><td>Invitrogen</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>podstawkowa pożywka niezbędna (MEM) (10')</td><td>Invitrogen</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>niezbędne aminokwasy MEM (100')</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>zestaw do klonowania TA z pCR 2.1</td><td>Invitrogen</td><td>K2040-01</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie specyficznych dla typu komórek aptamerów przeciwko gp120 hiv do dostarczania sirna

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

Globalna epidemia zakażeń HIV stworzyła pilną potrzebę opracowania nowych klas leków antyretrowirusowych. Wykorzystuje się silną zdolność małych interferujących (si)RNA do hamowania ekspresji komplementarnych transkryptów RNA jako nową klasę terapeutyków w leczeniu wielu chorób, w tym HIV. Wiele wcześniejszych doniesień wykazało, że nowatorskie strategie terapeutyczne przeciwko HIV/AIDS oparte na RNAi wykazują znaczny potencjał; jednak kluczową przeszkodą w skutecznym zastosowaniu terapeutycznym i translacji klinicznej siRNAs jest efektywne dostarczanie. Biorąc pod uwagę bezpieczeństwo i skuteczność terapii opartych na RNAi, szczególnie pożądane jest opracowanie metody celowanego wewnątrzkomórkowego dostarczania siRNA do konkretnych populacji komórek lub tkanek. Białko HIV-1 gp120, glikoproteina otoczki na powierzchni HIV-1, odgrywa istotną rolę w wnikaniu wirusa do komórek CD4. Interakcja gp120 i CD4, która wyzwala wniknięcie HIV-1 i inicjuje fuzję komórkową, została potwierdzona jako klinicznie istotna strategia przeciwwirusowa w poszukiwaniu nowych leków.
W niniejszej pracy omawiamy w pierwszej kolejności wybór i identyfikację zmodyfikowanych 2'-F aptamerów RNA przeciwko białku gp120 HIV. Wykorzystując konwencjonalną metodę SELEX z filtrem nitrocelulozowym, wyizolowano kilka nowych aptamerów o powinowactwie nanomolarnym z biblioteki 50 losowych nukleotydów nt RNA. Aby skutecznie uzyskać wiążące się gatunki o wyższym powinowactwie, rygorystyczność selekcji była starannie kontrolowana poprzez dostosowanie warunków. Wybrane aptamery mogą specyficznie wiązać się i być szybko internalizowane do komórek wykazujących ekspresję białka otoczki HIV-1. Ponadto same aptamery mogą neutralizować zakaźność HIV-1. W oparciu o najlepszy aptamer A-1 stworzyliśmy również nową chimerę aptamer-siRNA o podwójnej funkcji inhibicyjnej przeciwko gp120, w której zarówno część aptamerowa, jak i część siRNA wykazują silną aktywność przeciwko HIV. Dalej wykorzystujemy chimery aptamer-siRNA gp120 do specyficznego dla typu komórek dostarczania siRNA do zainfekowanych komórek HIV-1. Ta chimera o podwójnej funkcji wykazuje znaczny potencjał w łączeniu różnych terapeutycznych czynników kwasów nukleinowych (aptameru i siRNA) w celu hamowania infekcji HIV-1, co czyni chimery aptamer-siRNA atrakcyjnymi kandydatami terapeutycznymi dla pacjentów, u których wysokoaktywna terapia antyretrowirusowa (HAART) nie przynosi efektów.

Kilka aptamerów 2’-Fluoro RNA przeciwko HIV-1Ba-L gp120 o powinowactwie nanomolowym zostało wyizolowanych z biblioteki RNA za pomocą procedury in vitro SELEX. Stworzono nową chimerę aptamer-siRNA o podwójnej funkcji hamującej przeciwko gp120, która wykazuje znaczny potencjał w systemowej terapii przeciw HIV.

Opracowanie specyficznych dla typu komórek aptamerów przeciwko gp120 HIV do dostarczania siRNA

Globalna epidemia zakażeń wirusem HIV stworzyła pilną potrzebę opracowania nowych klas leków antyretrowirusowych. Silna zdolność małych interferujących...

Ogólnym celem następujących eksperymentów jest generowanie w vitro aptamerów RNA dla białka HIV-1 gp120 przy użyciu błony nitrocelulozowej. Zostaje to osiągnięte poprzez PCR i następującą po nim transkrypcję in vitro za pomocą polimerazy T7. W celu przygotowania początkowego DNA i losowej biblioteki RNA, w drugim kroku mieszaninę białka docelowego i biblioteki RNA nanosi się na uprzednio zwilżony filtr nitrocelulozowy, co umożliwia wyizolowanie związanych cząsteczek RNA od nie związanych frakcji RNA.Po 12 cyklach selekcji biblioteka RNA zostaje sklonowana i zsekwencjonowana w celu zidentyfikowania poszczególnych kandydujących aptimerów RNA z biblioteki. Uzyskane wyniki pozwalają zidentyfikować kilka nowych aptimerów o powinowactwie nanomolarnym, na podstawie analiz przesunięcia elektroforetycznego (gel shift assay) i mikroskopii konfokalnej. Główną zaletą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak koraliki (beads) czy metody izolacji oparte na kolumnach, jest ich prostota oraz brak konieczności wstępnego przygotowania białek lub bibliotek, na przykład poprzez unieruchamianie białka na koralikach. Biblioteka RNA do izolacji aptimerów RNA przeciwko HIV GP120 jest przygotowywa

development-cell-type-specific-anti-hiv-gp120-aptamers-for-sirna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opracowanie specyficznych dla typu komórki aptamerów przeciwko HIV gp120 do dostarczania siRNA

Zrozumienie konformacji antygenów powierzchniowych wirusa jest niezbędne do oceny neutralizacji przeciwciał i kierowania projektem skutecznych immunogenów szczepionkowych. W tym miejscu opisujemy komórkowy test ELISA, który umożliwia badanie rozpoznawania trimerycznego HIV-1 Env ulegającego ekspresji na powierzchni transfekowanych komórek przez specyficzne przeciwciała anty-Env.

Ocena konformacyjna glikoprotein otoczki trymerowej HIV-1 przy użyciu komórkowego testu ELISA

Tutaj prezentujemy protokół do generowania wektora Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 o nazwie Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 poprzez wykorzystanie strategii inkorporacji antygenu kapsydu. Wykazano, że wektor ten wykazuje przydatność jakościową, zdolność do ucieczki z surowic Ad5-dodatnich in vitro oraz antygenowość i immunogenność w stosunku do włączonych antygenów.

Wykorzystanie strategii inkorporacji kapsydu antygenu do opracowania metod szczepień z wektorem 5 serowirusa

Opisano metody oceny skuteczności i toksyczności cząsteczek RNA ukierunkowanych na etapy postintegracyjne cyklu replikacji HIV-1. Metody te są przydatne do badań przesiewowych nowych cząsteczek i optymalizacji formatu istniejących.

Ocena skuteczności i toksyczności RNA ukierunkowanych na produkcję HIV-1 do stosowania w terapii genowej lub lekowej

Modułowe podejście do syntezy N-glikanów do dołączania do szkiełka pokrytego tlenkiem glinu (ACG) jako mikromatrycy glikanowej zostało opracowane i zademonstrowano jego zastosowanie do profilowania przeciwciała neutralizującego wirusa HIV.

Chemoenzymatyczna synteza N-glikanów do tworzenia macierzy i profilowania przeciwciał HIV

Opisujemy test oparty na komórkach, który informuje o fuzji HIV-1 poprzez ekspresję białka zielonej fluorescencji wykrywalnego za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii fluorescencyjnej. Może być stosowany do testowania inhibitorów wnikania wirusa (szczególnie na etapie fuzji) w systemach infekcji bezkomórkowych i międzykomórkowych.

Wysokoprzepustowy test fuzji błony wirusowej aktywowanej Cre-Lox w celu identyfikacji inhibitorów fuzji błony wirusowej HIV-1

Szczegółowa metoda jest tutaj opisana jako oczyszczanie, ponowne fałdowanie i charakterystyka samoorganizujących się nanocząstek białkowych (SAPN) do wykorzystania w opracowywaniu szczepionek.

Wytwarzanie samoorganizujących się nanocząstek białkowych z ekspresją E. coli do szczepionek wymagających prezentacji epitopów trymerycznych

Białko rekombinowanego przeciwciała wyrażone w komórkach pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO oraz przeciwciała monoklonalne wytworzone przy użyciu tradycyjnej technologii hybrydoma mogą rozpoznawać i wiązać się z białkiem N (APN) aminopeptydazy świni.

Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko aminopeptydazie N w nabłonku błony śluzowej jelit świń

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania epitopów neutralizacji na cząsteczkach wirusopodobnych wyświetlających antygen (VLP). Immunoprecypitację VLP pochodzących z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) przeprowadza się przy użyciu przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla glikoprotein otoczkowych sprzężonych z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z białkiem G. Przechwycone VLP są następnie poddawane analizie SDS-PAGE i Western blot przy użyciu przeciwciał specyficznych dla białka rdzenia...

Wykrywanie epitopów wrażliwych na neutralizację w antygenach wyświetlanych na szczepionkach opartych na cząsteczkach wirusopodobnych (VLP) za pomocą testu wychwytywania

Wzór glikozylacji przeciwciała determinuje jego skuteczność kliniczną, dlatego przemysłowe i akademickie wysiłki zmierzające do kontroli glikozylacji trwają. Ponieważ typowe kampanie glikoinżynieryjne są czasochłonne i pracochłonne, przydatne byłoby opracowanie szybkiego protokołu do scharakteryzowania wpływu genów glikozylacji za pomocą przejściowego wyciszania.

Szybka glikoinżynieria przeciwciał w komórkach jajnika chomika chińskiego

Udostępniamy protokół, który może być ogólnie stosowany do wybranych aptamerów, które wiążą się tylko z wirusami zakaźnymi, a nie z wirusami, które stały się niezakaźne za pomocą metody dezynfekcji lub z innymi podobnymi wirusami. Otwiera to możliwość określenia statusu zakaźności w testach przenośnych i szybkich.

Selekcja aptamerów in vitro w celu odróżnienia wirusów zakaźnych od niezakaźnych

Poznaj metodę SELEX na filtrze nitrocelulozowym do izolacji wysokoafinicznych aptamerów RNA przeciwko białku gp120 HIV-1 oraz tworzenia chimerycznych cząsteczek aptamer-siRNA dla celowanej terapii antywirusowej.

Opracowanie specyficznych dla typu komórek aptamerów przeciwko gp120 HIV do dostarczania siRNA

Przeglądaj więcej filmów