Name: Izolacja ludzkich wysp trzustkowych od pacjentów po częściowej pankreatektomii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Poznaj metodę izolacji wysp trzustkowych od pacjentów po częściowej pankreatektomii. Protokół wykorzystuje trawienie enzymatyczne i gradient gęstości do uzyskania żywych wysp do badań nad cukrzycą typu 2.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pragniemy podziękować wszystkim współpracownikom, którzy udzielili pomocy, porad i krytycznych uwag na różnych etapach projektu. Produkcja niniejszego artykułu wideo była możliwa dzięki funduszom z niemieckiego Ministerstwa Edukacji i Badań (BMBF) przekazanym do Niemieckiego Centrum Badań nad Cukrzycą (DZD). <a href="http://www.dzd-ev.de">http://www.dzd-ev.de</a>), IMIDIA (<a href="http://www.imidia.org">http://www.imidia.org</a>) oraz Szpital Uniwersytecki Carl Gustav Carus przy Uniwersytecie Technicznym w Dreźnie. Badania, które doprowadziły do tych wyników, zostały sfinansowane z programu ramach Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013) Wspólnoty Europejskiej w ramach Innovative Medicine Initiative na podstawie umowy grantowej nr&deg; 115005.

1. Pobieranie tkanki trzustki na sali operacyjnej
<ol>
	<li>Chirurg wykonuje częściową resekcję trzustki.</li>
	<li>Po umieszczeniu preparatu trzustki w pojemniku z lodem, należy niezwłocznie przekazać go patologowi.</li>
</ol>
2. Wybór tkanki do izolacji wysepek
<ol>
	<li>Patolog wybiera tkankę, która wydaje się miękka i zdrowa, zachowując tkankę uszkodzoną do celów diagnostycznych. Tkanka włóknista oraz próbki zawierające mniej niż 2 g tkanki nadającej się do użycia są wykluczane z izolacji wysepek.</li>
	<li>Zanurz tkankę trzustki w roztworze Euro Collins i dostarcz ją do laboratorium w transporcie w lodzie.</li>
</ol>
3. Izolacja ludzkich wysepek
<ol>
	<li>Zważ tkankę trzustki, a następnie umieść ją w szalce o średnicy 10 cm.</li>
	<li>Wlej 150 ml pożywki RPMI do kolby o pojemności 500 ml.</li>
	<li>W kolbie o pojemności 250 ml przygotuj roztwór enzymów trawiennych, łącząc 130 ml pożywki RPMI z 100 mg/ml DNazy oraz 20 ml Liberazy RI w stężeniu 5mg/ml. Pobierz 10 ml tego roztworu do strzykawki w celu wstrzyknięcia go do tkanki trzustki.</li>
	<li>Wstrzyknij roztwór enzymów trawiennych do tkanki trzustki tak, aby rozciągnąć ją jednorodnie. Jeśli uniemożliwia to zwłóknienie, trawienie prawdopodobnie nie powiedzie się. Następnie posiekaj tkankę na kawałki o rozmiarze ~4 mm3 na lodzie.</li>
</ol>
4. Obwód trawienia trzustki ludzkiej
<ol>
	<li>Zmontować układ do trawienia zgodnie z rysunkiem 1. Kierunek przepływu w komorze Ricordiego jest w na dnie i na zewnątrz na górnej części komory.</li>
	<li>Dolać pozostały roztwór enzymów trawiennych do kolby o pojemności 500 ml do osiągnięcia całkowitej objętości 300 ml i włożyć termometr.</li>
	<li>Przenieś tkankę trzustkową do komory, włóż siatkę (średnica porów: 600 μm) oraz trzy kulki z azotku krzemu (średnica: 15 mm), zamknąć komorę i uruchomić pompę przy ustawionym przepływie 140 ml/min.</li>
	<li>Gdy temperatura obwodu osiągnie 37 °Cnastępnie należy rozpocząć pomiar czasu i okresowo pobierać próbki, aby określić moment zakończenia trawienia. Barwienie dytyzonem (2 mg/ml) umożliwia wizualizację wysp trzustkowych w tkance poddanej trawieniu pod mikroskopem4.</li>
	<li>Po oddzieleniu wysepek od otaczającej tkanki acinarnej należy szybko przerwać proces trawienia, umieszczając cewkę grzewczą w lodzie i dodając do układu 200 ml zimnego medium płuczącego (900 ml RPMI 1640 z 5,5 mM glukozy i 10% FBS).</li>
	<li>Zbierać roztwór wysepek do probótek stożkowych o pojemności 250 ml w miarę wypływania go z probówki z próbką. Kontynuować proces do momentu opróżnienia układu.</li>
</ol>
<img alt="Schemat obwodu trawienia ludzkiej trzustki; komora Ricordiego, kolba Erlenmeyera, proces cewki grzejnej." src="/files/ftp_upload/2962/2962fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Obwód trawienia ludzkiej trzustki Obwód trawienia ludzkiej trzustki obejmuje komorę Ricordiego zawierającą siatkę (średnica porów: 600 μm) oraz trzy kulki z azotku krzemu (średnica: 15 mm). Odpływ z komory jest kierowany do kolby do zbierania tkanek za pomocą pompy perystaltycznej (140 ml/min). Strzałki wskazują kierunek przepływu. Optymalna temperatura trawienia enzymatycznego jest utrzymywana poprzez zanurzenie cewki grzejnej w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
5. Płukanie po trawieniu
<ol>
	<li>Odwiruj probówki stożkowe o pojemności 250 ml zawierające roztwór wysepek w temperaturze 4 °C przy 1000 rpm przez 5 min.</li>
	<li>Odlej nadsącz, resuspenduj osad z wysepek w medium do przemywania (900 ml RPMI 1640 z 5,5 mM glukozą i 10% FBS) i rozdziel go na równe frakcje do probówek stożkowych o pojemności 50 ml. (Opcjonalnie: Rozdziel do dodatkowych probówek stożkowych w celu poprawy jakości przemywania). Odwiruj przy 1000 rpm, 4 °C przez 5 min.</li>
	<li>Odlej nadsącz i delikatnie rozluźnij osady poprzez ręczne potrząsanie.</li>
</ol>
6. Oczyszczanie na gradiencie Ficoll
<ol>
	<li>Resuspend osad w medium Ficoll o gęstości 1,125 g/ml, pH 7,4, a następnie powoli nałóż warstwami 10 ml aliquotów medium Ficoll o gęstościach 1,080, 1,060 i 1,037 g/ml.</li>
	<li>Odwiruj gradienty Ficoll przy 2400 rpm, 4°C przez 20 min.</li>
</ol>
7. Izolacja i hodowla wysepek
<ol>
	<li>Po odwirowaniu można rozróżnić poszczególne komponenty tkanki na podstawie ich rozmieszczenia w gradiencie.</li>
	<li>Usunąć górną warstwę składającą się z tłuszczu i tkanki łącznej.</li>
	<li>Ostrożnie zebrać pierwszą warstwę agregatów wysepek na interfazie 1,037-1,060 g/ml. Warstwa ta zawiera najczystsze izolowane wysepki. Frakcje należy zbierać osobno w celu zapewnienia wydajnej izolacji.</li>
	<li>Zebrać drugą, mniej czystą frakcję agregatów wysepek na interfazie 1,060-1,080 g/ml.</li>
	<li>Rozcieńczyć gradient Ficoll, dodając do każdej probówki stożkowej medium do płukania (900 ml RPMI 1640 z 5,5 mM glukozy i 10% FBS) do uzyskania całkowitej objętości 50 ml. Wirować przy 1000 rpm w temperaturze 4°C przez 5 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant za pomocą odsysania. Należy zachować ostrożność, ponieważ osad może być niestabilny ze względu na gradient Ficoll.</li>
	<li>Przepłukać osady medium do płukania (900 ml RPMI 1640 z 5,5 mM glukozy i 10% FBS) i wirować przy 1000 rpm w temperaturze 4°C przez 5 min. Powtórzyć czynność, używając medium do hodowli wysepek.</li>
	<li>Resuspendować wysepki w medium do hodowli i umieścić je w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C na 24-48 godzin przed dalszą obróbką.</li>
</ol>

<ol><li>Kahn, S. E., Zraika, S., Utzschneider, K. M., Hull, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta+cell+lesion+in+type+2+diabetes%3A+there+has+to+be+a+primary+functional+abnormality%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The beta cell lesion in type 2 diabetes: there has to be a primary functional abnormality.</a> Diabetologia. 52, 1003-1012 (2009).</li>
<li>Deng, S., Vatamaniuk, M., Huang, X., Doliba, N., Lian, M. M., Frank, A., Velidedeoglu, E., Desai, N. M., Koeberlein, B., Wolf, B., Barker, C. F., Naji, A., Matschinsky, F. M., Markmann, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+abnormalities+in+the+islets+isolated+from+type+2+diabetic+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Structural and functional abnormalities in the islets isolated from type 2 diabetic subjects.</a> Diabetes. 53, 624-632 (2004).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Finke, E. H., Olack, B. J., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+method+for+isolation+of+human+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated method for isolation of human pancreatic islets.</a> Diabetes. 37, 413-420 (1988).</li>
<li>Latif, Z. A., Noel, J., Alejandro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+staining+fresh+and+cultured+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">A simple method of staining fresh and cultured islets.</a> Transplantation. 45, 827-830 (1988).</li>
<li>Ehehalt, F., Knoch, K., Erdmann, K., Krautz, C., Jäger, M., Steffen, A., Wegbrod, C., Meisterfeld, R., Kersting, S., Bergert, H., Kuhlisch, E., Bornstein, S., Bonifacio, E., Saeger, H. D., Solimena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin+turnover+in+islets+from+type+2+diabetic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin turnover in islets from type 2 diabetic patients.</a> Islets. 2, 30-36 (2010).</li>
<li>Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+pancreatic+diabetes+%28type+3c+diabetes%29+underdiagnosed+and+misdiagnosed%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed?</a> Diabetes Care. 31, Suppl 2. S165-S169 (2008).</li>
<li>Meisterfeld, R., Ehehalt, F., Saeger, H. D., Solimena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+disorders+and+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Clin+Endocrinol+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pancreatic disorders and diabetes mellitus.</a> Exp Clin Endocrinol Diabetes. 116, Suppl 1. S7-S12 (2008).</li>
<li>Verge, C. F., Gianani, R., Kawasaki, E., Yu, L., Pietropaolo, M., Jackson, R. A., Chase, H. P., Eisenbarth, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+type+I+diabetes+in+first-degree+relatives+using+a+combination+of+insulin%2C+GAD%2C+and+ICA512bdc%2FIA-2+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Prediction of type I diabetes in first-degree relatives using a combination of insulin, GAD, and ICA512bdc/IA-2 autoantibodies.</a> Diabetes. 45, 926-933 (1996).</li>
<li>Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition%2C+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+and+its+complications.+Part+1%3A+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+provisional+report+of+a+WHO+consultation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabet+Med%22%5BJournal%5D)">Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation.</a> Diabet Med. 15, 539-553 (1998).</li>
<li>Marselli, L., Thorne, J., Ahn, Y. B., Omer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+of+Purified+%7Bbeta%7D-Cell+Tissue+Obtained+from+Human+Pancreas+with+Laser+Capture+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection.</a> Journal of Clin. Endocrinol. Metab. 93, 1046-1053 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Stosując nasz protokół, można wyizolować ludzkie wysepki z tkanki trzustki pobranej podczas częściowej pankreatektomii. Sukces tego protokołu zależy od staranności zachowanej w kilku krytycznych punktach. Aby zachować żywotność komórek beta, niezbędne jest szybkie przetransportowanie próbki do laboratorium w lodzie. Ponadto czas trawienia tkanki musi zostać zoptymalizowany empirycznie, w zależności od stopnia włóknienia tkanki oraz aktywności enzymatycznej medium. Dotyczy to również siły mechanicznej przykładanej ręcznie do komory Ricordi. Zatem, aby uzyskać dobrą wydajność izolacji wysepek, protokół ten najlepiej przeprowadzić przez wyspecjalizowanego naukowca lub asystenta technicznego. Początkowe niepowodzenia są normą, chyba że zespół posiada już doświadczenie w izolacji wysepek.
Istnieją kluczowe różnice między naszym protokołem izolacji wysepek a standardową metodą izolacji ludzkich wysepek: 1) Choć wykorzystujemy tkankę trzustkową poddaną wielogodzinnej ischemii podczas procedury chirurgicznej, jest ona natychmiast przetwarzana na miejscu. Kontrastuje to z trzustkami pobranymi od dawców z potwierdzonym śmiercią mózgową w celu transplantacji trzustki/wysepek, które pozostają w stanie ischemii przez kilka godzin podczas alokacji i transportu do ośrodka izolacji wysepek. 2) Kolagenazę wstrzykujemy bezpośrednio do tkanki trzustki, podczas gdy w standardowym protokole podaje się ją do przewodów trzustkowych. 3) Wysepki oddzielamy przy użyciu nieciągłego gradientu Ficollu, zamiast zbierać je z ciągłego gradientu Ficollu za pomocą procesora komórkowego COBE.
W przypadkach, gdy materiał chirurgiczny jest zbyt zwłókniały lub zbyt mało obfity, aby wyizolować odpowiednią liczbę wysepek, tkankę można nadal pobrać za pomocą laserowej mikrosekcji (LCM)10. Pozwala to na odzyskanie danych o ekspresji genów z niemal każdego preparatu, nawet jeśli izolacja wysepek nie powiedzie się lub wydajność będzie bardzo niska. Niestety, LCM nie dostarcza żywych komórek do badań funkcjonalnych, a ich ilość jest zazwyczaj niewystarczająca do analiz proteomicznych. Zatem stosowanie LCM równolegle z naszym protokołem trawienia kolagenazą w celu odzyskania wysepek może być najskuteczniejszą metodą przetwarzania materiałów chirurgicznych.
Podczas pobierania tkanek do izolacji wysepek z zakresowych pancreatektomii ważne jest dokładne zbadanie historii klinicznej i stanu metabolicznego pacjenta. Pacjent po pancreatektomii zakresowej może cierpieć na cukrzycę typu 3c, czyli cukrzycę wtórną do schorzenia trzustki, które stało się przyczyną operacji6. Wśród 43 pacjentów, którzy zostali poddani tej operacji w naszym oddziale w 2010 roku, 32 nie miało cukrzycy, 5 cierpiało na cukrzycę typu 2, a 6 na cukrzycę typu 3c. Dane te są zgodne z wcześniejszymi badaniami wskazującymi na zaburzenia metabolizmu glukozy i cukrzycę u znacznej części pacjentów cierpiących na raka trzustki lub przewlekłe zapalenie trzustki6. Cukrzycę uznano za pierwotną, jeśli została zdiagnozowana co najmniej rok przed wystąpieniem objawów prowadzących do operacji trzustki7. Należy również zmierzyć poziom przeciwciał przeciwko autoantygenom wysepek, aby ocenić potencjalne autoimmunologiczne podłoże cukrzycy8. Ponieważ pacjent poddawany pancreatektomii może cierpieć na niezdiagnozowaną cukrzycę lub mieć zaburzenia tolerancji glukozy, wszyscy pacjenci bez cukrzycy powinni przejść doustny test tolerancji glukozy przed zabiegiem pancreatektomii9.

izolacja wysepek trzustkowych człowieka od pacjentów po częściowej pankreatektomii

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Badania nad patogenezą cukrzycy typu 2 oraz dysfunkcją wysepek Langerhansa 1 były utrudnione ze względu na ograniczoną dostępność wysepek od dawców organów z cukrzycą typu 22. Przedstawiamy nasz protokół izolacji wysepek z tkanki trzustki ludzkiej pobranej od pacjentów z cukrzycą typu 2 oraz pacjentów bez cukrzycy, którzy przeszli częściową pancreatektomię z powodu różnych chorób trzustki (łagodnych lub złośliwych guzów trzustki, przewlekłego zapalenia trzustki oraz guzów przewodu żółciowego wspólnego lub dwunastnicy). Wszyscy uczestniczący pacjenci wyrazili zgodę na udział w badaniu, które zostało również zatwierdzone przez lokalny komitet etyki. Materiały chirurgiczne zostały niezwłocznie przekazane patologowi, który wybrał miękką i wyglądającą na zdrową tkankę trzustki do izolacji wysepek, zachowując tkankę uszkodzoną do celów diagnostycznych. Stwierdziliśmy, że aby wyizolować ponad 1000 wysepek, musieliśmy rozpocząć od co najmniej 2 g tkanki trzustki. Kluczowym elementem naszego protokołu było również widoczne rozciągnięcie tkanki podczas wstrzykiwania medium zawierającego enzymy, a następnie jej posiekanie, aby ułatwić trawienie poprzez zwiększenie powierzchni kontaktu.
Aby rozszerzyć zakres zastosowania naszego protokołu na rzadkie przypadki, w których dostępna jest duża ilość (&gt;15g) tkanki trzustki ludzkiej, do trawienia tkanki użyliśmy komory Ricordiego (50 ml). Podczas trawienia ręcznie wstrząsaliśmy komorą Ricordiego3 z intensywnością zależną od stopnia włóknienia tkanki w danej próbce. Następnie zastosowano nieciągły gradient Ficollu w celu oddzielenia wysepek od tkanki acynarnej. Zauważyliśmy, że osad tkankowy powinien być na tyle mały, aby można go było homogenicznie resuspenderować w medium Ficoll o gęstości 1,125 g/ml. Po izolacji hodowaliśmy wysepki w warunkach wolnych od stresu (bez wstrząsania lub rotacji) w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez co najmniej 48 h, aby ułatwić ich regenerację funkcjonalną. Powszechne zastosowanie naszego protokołu i jego przyszłe udoskonalenie mogłyby umożliwić terminowe pozyskiwanie dużych ilości ludzkich wysepek od osób z cukrzycą oraz dopasowanych klinicznie osób niediabetycznych, co znacznie przyspieszyłoby badania nad cukrzycą typu 2.

Nasz protokół pozwolił na uzyskanie średnio ~500 wysepek na gram tkanki trzustki, choć wartość ta znacznie różniła się między preparatami, co wynikało głównie z różnic w stopniu włóknienia oraz aktywności kolagenazy. Osiągnęliśmy czystość wysepek &gt; 90% poprzez wstępne barwienie dytyzonem podczas przetwarzania tkanki, a następnie ręczny wybór wysepek 24 godziny po izolacji. Aby określić jakość oczyszczonych wysepek, przeprowadziliśmy test wydzielania insuliny stymulowanego 25 mM glukozą w warunkach statycznych przez 2 godziny. Stwierdzono, że wydzielanie insuliny było porównywalne do poziomu uzyskiwanego z wysepek pochodzących z centrów izolacji i transplantacji wysepek ECIT. Ponieważ wysepki izolowane z trzustek po częściowej pancreatektomii nie są przeznaczone do transplantacji, ocenę całkowitego IEQ nie uznano za czynnik krytyczny.
Co istotne, nasza metoda pozwoliła nam na wyizolowanie wysepek do badań funkcjonalnych od 25 pacjentów po częściowej pancreatektomii w latach 2005–20085. Wysepki te poddano analizie w kierunku insulinozależnej sekrecji glukozy oraz specyficznej ekspresji białek za pomocą techniki western blotting i immunohistochemii. Wysepki wyizolowane z trzustek po częściowej pancreatektomii mogą być również wykorzystane do porównania profili ekspresji genów i białek, wyglądu ultrastrukturalnego oraz odpowiedzi funkcjonalnych wysepek u osób zdrowych i chorych na cukrzycę. Ponieważ liczba pacjentów poddawanych częściowej pancreatektomii jest większa niż liczba dawców narządów, nasz protokół może umożliwić zgromadzenie wystarczającej liczby próbek i danych do przeprowadzenia rzetelnej analizy statystycznej.

Dostępność wysepek trzustkowych od osób z cukrzycą typu 2 do celów badawczych jest niewystarczająca. Przedstawiamy tutaj nasz protokół izolacji wysepek od pacjentów poddawanych częściowej pankreatektomii. Podejście to stanowi unikalną możliwość pozyskania wysepek od osób z cukrzycą typu 2 oraz klinicznie dopasowanych osób niediabetycznych w liczbie odpowiedniej do badań podstawowych i klinicznych.

Izolacja wysepek trzustkowych człowieka od pacjentów po częściowej pankreatektomii

Badania nad patogenezą cukrzycy typu 2 oraz dysfunkcją wysepek Langerhansa 1 były utrudnione ze względu na ograniczoną dostępność typu 2...

Witam, nazywam się Florian Al i reprezentuję Katedrę Chirurgii na Uniwersytecie Technicznym w Triton. Cześć, jestem Gregor Cher, również z Katedry Chirurgii w Szpitalu Uniwersyteckim w Grayston.Badania nad biologią i funkcją powiek są niezbędne do pogłębienia naszej wiedzy na temat fizjologii powiek oraz patogenezy cukrzycy. Niestety, bardzo trudno jest pozyskać ludzkie powieki od pacjentów zdrowych oraz pacjentów z cukrzycą typu 2. Poniższa sekwencja wideo zaprezentuje protokół izolacji ludzkich powiek od pacjentów po częściowej pankreatektomii.Tak pozyskane wysepki mogą służyć jako układ in vitro do analizy funkcjonalnej. Warunkiem wstępnym izolacji ludzkich wysepek jest chirurgiczna resekcja tkanki trzustki człowieka. Korzystamy z materiału pobranego od pacjentów poddawanych częściowej resekcji trzustki z powodu konkretnych patologii trzustki.W celu pozyskania ludzkiej tkanki trzustki chirurg wykonuje nacięcie trzustki i przeprowadza resekcję częściową. Następnie wycinek trzustki jest umieszczany w lodzie i transportowany do Zakładu Patomorfologii. Patomorfolog określa ilość zdrowo wyglądającej i miękkiej tkanki trzustki do pobrania.Do izolacji wysepek trzustkowych wymagane są co najmniej dwa gramy tkanki trzustkowej. Tkankę umieszcza się w roztworze ucon i transportuje w lodzie do laboratorium. Pierwszym krokiem w procesie izolacji wysepek jest pomiar masy tkanki trzustkowej.Następnie próbkę umieszcza się w szalce o średnicy 10 cm. Przygotowano już jedną kolbę o pojemności 500 ml zawierającą 150 ml medium RPMI oraz jedną kolbę o pojemności 250 ml zawierającą 130 ml medium RPMI. Następnie do kolby 250 ml dodaje się roztwór enzymu trawiennego zawierający 1 ml DNAs oraz 20 ml kolagenazy, a następnie pobiera go do strzykawki o pojemności 10 ml.Oczyszczoną tkankę trzustki rozszerza się następnie poprzez wstrzyknięcie pożywki zawierającej enzymy, a następnie sieka na małe kawałki, aby zwiększyć powierzchnię kontaktu i ułatwić proces trawienia. Ten etap siekania jest kluczowy, ponieważ samo rozszerzenie poprzez wstrzyknięcie nie zapewnia odpowiedniego rozprowadzenia enzymu w tkance. Równolegle przygotowaliśmy układ do trawienia.Jak pokazano na tej rysunku, kierunek przepływu w komorze pomiarowej prowadzi z dołu do góry komory. Następnie przelewamy pozostałe medium zawierające enzym do kolby o pojemności 500 ml do objętości 300 ml, a następnie wkładamy termometr. Komora pomiarowa zawiera metalową siatkę o średnicy oczek 600 µm oraz wolne kulki z azotku krzemu o średnicy 15 mm każda.Przenosimy tkankę trzustki do komory, wkładamy siatkę, zamykamy komorę i uruchamiamy pompę z prędkością 140 ml/min. Po osiągnięciu w obwodzie temperatury 37 °C rozpoczynamy pomiar czasu trawienia. Komora z materiałem jest potrząsana ręcznie, zależnie od składu tkanki.Aby określić optymalny moment zakończenia trawienia, pobieramy okresowo próbki, barwimy je i oceniamy stopień oddzielenia rąbek pod mikroskopem. Gdy rąbek wydają się być oddzielone od tkanki łącznej, szybko przerywamy trawienie, umieszczając wężownicę grzejną w lodzie i dodając do układu 200 ml zimnego medium płuczącego. Następnie zbieramy roztwór z rąbkami, przelewając go do probówek typu Falcon o pojemności 250 ml, aż układ będzie pusty.Poniższa procedura płukania rozpoczyna się od etapu wirowania z prędkością 1000 RPM w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. W kolejnym kroku odrzucamy nadsącz, resuspendujemy osad w medium płuczącym i rozdzielamy go na równe frakcje do probótek typu Falcon o pojemności 50 ml. Płukanie kontynuuje się kolejnym etapem wirowania z prędkością 1000 RPM w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.W ramach kroku opcjonalnego, w zależności od wielkości próbki, rozdzielamy ją do dodatkowych probówek typu Falcon, poza pierwotne cztery. Aby usprawnić proces płukania, ponownie odrzucamy nadsącz i delikatnie rozluźniamy próbkę w celu oddzielenia powieki od tkanki otaczającej. Różna gęstość tkanki obu części umożliwia zastosowanie gradientu gęstości.Najpierw resuspendujemy osad w medium kałowym o gęstości 1,125 g/ml. Osad musi być na tyle mały, aby umożliwić homogeniczną resuspensję. Następnie powoli nakładamy na niego media kałowe o gęstościach 1,081060 oraz 1,037, w objętości 10 ml każde.Następnie wirujemy gradienty z prędkością 2 400 RPM przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Teraz można rozróżnić poszczególne komponenty oddzielone w frakcjach na podstawie ich gęstości. W pierwszej kolejności odrzucamy górną warstwę składającą się z tłuszczu i tkanki łącznej.Frakcja, którą teraz zbieramy, to pierwsza warstwa agregatu powiek przy gęstości 1,037 i 1,06, która zawiera głównie wyizolowane oczka. Dla zapewnienia wydajnej izolacji ważne jest, aby zbierać frakcje oddzielnie. Następnie zbieramy frakcję drugiego agregatu powiek na granicy 1,060 i 1,080, która zawiera mniej czyste oczka niż pierwsza warstwa.Następnie dodajemy medium piorące do uzyskania całkowitej objętości 50 ml w celu rozcieńczenia gradientu kałowego, a następnie wirujemy w celu oddzielenia osadu (FUT) przy 1000 RPM przez pięć minut. W temperaturze 4 °C odsysamy nadsącz (SUP), ponieważ pellet może być bardzo luźny z powodu zimnego barwienia. W związku z tym należy powtórzyć etap płukania w medium hodowlanym przy 1000 RPM przez pięć minut w temperaturze 4 °C.W ostatnim kroku resuspendujemy ludzkie fragmenty rogówki (eyelets) w pożywce hodowlanej i inkubujemy je. Zebrane fragmenty rogówki pozostawiamy w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 24 do 48 godzin. Po tym etapie hodowli fragmenty rogówki są gotowe do dalszego przetwarzania.Niniejszy protokół powinien umożliwić wyizolowanie ludzkich wysepek trzustkowych z tkanki trzustki po częściowej pancreatektomii. Szybki transport schłodzonych wycinków trzustki do laboratorium izolacji wysepek jest kluczowy dla zachowania lepszej żywotności komórek. Zespół wykonujący izolację musi pamiętać, że proces trawienia jest procedurą wysoce dynamiczną.Czas trwania procesu trawienia w dużym stopniu zależy od składu tkanki, na przykład od stopnia włóknienia oraz możliwości wstrzyknięcia odpowiedniej ilości enzymów do tkanki trzustki. Indywidualne dostosowanie siły mechanicznej w komorze oraz długości procesu trawienia jest kluczowe dla uzyskania dobrej wydajności wyizolowanych wysepek.

isolation-of-human-islets-from-partially-pancreatectomized-patients

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Izolacja wysp ludzkich z pacjentów po częściowej pankreatektomii

Uzyskanie wysokiej jakości i odpowiedniej ilości ludzkich wysepek trzustkowych jest jednym z głównych warunków koniecznych do pomyślnego przeszczepienia wysepek. W niniejszym filmie opisujemy krok po kroku procedury izolacji ludzkich wysepek trzustkowych (część I: trawienie i pobieranie tkanki trzustki) z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody zautomatyzowanej.

Izolacja wysepek trzustkowych człowieka: Część I: Trawienie i pobieranie tkanki trzustki

Uzyskanie wysokiej jakości i odpowiedniej ilości ludzkich wysepek jest jednym z głównych warunków pomyślnego przeszczepienia wysepek. W tym filmie krok po kroku opisujemy procedury izolacji ludzkich wysepek trzustkowych (część II: oczyszczanie i hodowla ludzkich wysepek) z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody zautomatyzowanej.

Izolacja ludzkich wysepek trzustkowych: Część II: Oczyszczanie i hodowla ludzkich wysepek

Wyspy trzustkowe, zwane również wysepkami Langerhansa, to skupisko komórek endokrynnych, które produkują hormony do regulacji poziomu glukozy i innych ważnych funkcji biologicznych. Ten protokół wyjaśnia metodę izolowania wysp trzustkowych poprzez najpierw perfuzję kolagenazy przez Ampulla Vatera w celu trawienia zewnątrzwydzielniczej tkanki trzustki i uproszczone wirowanie gradientu gęstości w celu oczyszczenia wysp trzustkowych od myszy.

Izolacja wysp trzustkowych poprzez perfuzję kolagenazy: enzymatyczna metoda izolowania komórek wysp trzustkowych

Mikrodysekcja laserowa to technika, która pozwala na odzyskanie wybranych komórek z niewielkich ilości miąższu. W tym miejscu opisujemy protokół pozyskiwania ludzkich wysp trzustkowych z próbek chirurgicznych do wykorzystania w badaniach transkryptomicznych. Nasz protokół poprawia wewnętrzną autofluorescencję ludzkich komórek beta, ułatwiając w ten sposób ich pobieranie.

Ulepszony protokół mikrodysekcji laserowej ludzkich wysp trzustkowych z próbek chirurgicznych

Opisujemy tutaj protokół izolowania nienaruszonych wysepek od nowonarodzonych myszy. Trzustkę częściowo trawiono kolagenazą, a następnie myto i zbierano ręcznie. Od nowo narodzonych myszy można uzyskać od 20 do 80 klastrów wysp trzustkowych na trzustkę, które nadają się do kilku badań na wyspach trzustkowych.

Skuteczna izolacja funkcjonalnych wysp trzustkowych z trzustki noworodka myszy

Ten protokół izolacji wysp opisał nową drogę wstrzykiwania kolagenazy w celu trawienia tkanki zewnątrzwydzielniczej oraz uproszczoną procedurę gradientu do oczyszczania wysp trzustkowych z myszy. Obejmuje trawienie enzymatyczne, gradientową separację/oczyszczanie i ręczne zbieranie wysepek. Udana izolacja może dać 250–350 wysokiej jakości i w pełni funkcjonalnych wysepek na mysz.

Prosty protokół o wysokiej skuteczności izolacji wysp trzustkowych od myszy

Tutaj prezentujemy protokół do generowania wysokiej jakości, wielkoskalowych danych transkryptomu pojedynczych komórek z izolowanych ludzkich wysp trzustkowych przy użyciu technologii sekwencjonowania mikroprzepływowego jednokomórkowego RNA opartej na kropelkach.

Sekwencjonowanie i analiza RNA pojedynczych komórek ludzkich wysp trzustkowych

W tym miejscu podajemy szczegółowe informacje na temat stymulowanego glukozą wydzielania insuliny (GSIS) poprzez perfuzję przez naczynia krwionośne myszy z nienaruszoną trzustką jako dodatkową technikę oceny funkcji endokrynnej trzustki z redukcją możliwych czynników zakłócających.

Stymulowane glukozą wydzielanie insuliny poprzez perfuzję przez naczynia krwionośne myszy z nienaruszoną trzustką

Badanie to opracowało uproszczoną metodę efektywnego wyodrębniania funkcjonalnych wysetek pierwotnych i komórek acynarnych z trzustki myszy, co stanowi cenne narzędzie do badania komunikacji międzykomórkowej w patogenezie ostrej cukrzycy indukowanej zapaleniem trzustki.

Prosta i szybka metoda jednoczesnej izolacji pierwotnych wysp i pierwotnych komórek acinowych trzustki od myszy

Protokół ten opisuje ustandaryzowaną metodę chirurgicznego pobierania brań, trawienia enzymatycznego oraz oczyszczania wysetek trzustkowych szczurów Lewisa w gęście, umożliwiając przygotowania o wysokiej wydajności i wysokiej czystości do bezpośredniego zastosowania w przeszczepach lub badaniach in vitro .

Izolacja i oczyszczanie wysepek trzustkowych od szczurów Lewisa za pomocą trawienia enzymatycznego i rozdzielania gęstościowo-gradientowego

Poznaj metodę izolacji wysp trzustkowych od pacjentów po częściowej pankreatektomii. Protokół wykorzystuje trawienie enzymatyczne i gradient gęstości do uzyskania żywych wysp do badań nad cukrzycą typu 2.

Izolacja wysepek trzustkowych człowieka od pacjentów po częściowej pankreatektomii

Przeglądaj więcej filmów