Obrazowanie wapniowe reakcji wywołanych zapachem w płacie czułkowym Drosophila

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar aktywności fizjologicznej neuronów węchowych w dmuszkinie i płacie antenowym poprzez optyczne obrazowanie wewnątrzkomórkowych zmian wapnia. Osiąga się to poprzez pierwszy montaż bloku montażowego, uchwytu przewodu i osłony anteny. Następnie montowana jest mucha wyrażająca fluorescencyjny czujnik wapnia GCaMP i mocowana do bloku.

Po zamontowaniu muchy naskórek na górze główki muchy jest odcinany, aby odsłonić płatki anteny. Ostatnim krokiem zabiegu jest umieszczenie muchy pod mikroskopem i pobudzenie jej zapachem. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które wskazują na wzorce aktywności wywołanej zapachem w płatach anteny DLA poprzez zarejestrowane zmiany względnej fluorescencji czujnika wapnia G camp.

Metoda ta może pomóc w ujawnieniu, w jaki sposób zapachy są reprezentowane jako przestrzenne i czasowe wzorce aktywności neuronalnej na różnych poziomach obwodów węchowych. Główną przewagą tej techniki nad innymi metodami, takimi jak elektrofizjologia, jest to, że możemy rejestrować aktywność genetycznie zidentyfikowanych neuronów, które nie są dostępne dla elektrod rejestrujących. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w neuronalne przetwarzanie zapachów.

Może być również stosowany do innych obszarów mózgu, takich jak układ słuchowy i gazowy. Najpierw przekręć przez tylną część bloku montażowego z pleksi, tak aby nie wychodziły poza przód. Użyj precyzyjnego wiertła, aby zrobić wgniecenie w górnej granicy okrągłej komory dla muchy, kopiąc pod powierzchnią, aby zmniejszyć grubość bloku.

Pod lunetą sekcyjną przetnij miedzianą siatkę skalpelem prostopadłym i blisko dna szczeliny, aby stworzyć obrożę do trzymania muchy. Upewnij się, że dwie powstałe klapki są wypoziomowane, ponieważ pomoże to w włożeniu muchy. Za pomocą wykałaczki umieść małą kroplę super kleju na bloku montażowym nad okrągłą komorą.

W przypadku muchy umieść miedzianą siatkę na kleju i ustaw tak, aby szczelina była wyśrodkowana na bloku. Delikatnie dociśnij siatkę i usuń nadmiar kleju pęsetą. Dodaj maleńkie krople kleju pod klapkami z każdej strony i złóż siatkę z przodu bloku tak, aby szczelina była skierowana prosto w dół.

Upewnij się, że górna część siatki znajduje się na poziomie bloku i pozwól mu całkowicie wyschnąć. Aby zrobić uchwyt z drutu, przetnij plastikowe szkiełko nakrywkowe na pół i usuń środkowy element, aby uzyskać kształt litery U. Użyj wosku pszczelego, aby przykleić kawałek drutu w poprzek górnej części ciebie, aby drut nie był zbyt t.

Zbuduj osłonę anteny, używając papierowego dziurkacza, aby zrobić otwór w plastikowym szkiełku nakrywkowym. Przytnij krawędzie szkiełka nakrywkowego do 0,5 na 0,7 centymetra. Przyklej przebitą plastikową szkiełko osłonowe do taśmy klejącej, a następnie umieść kroplę etanolu na taśmie odsłoniętej przez otwór.

Aby usunąć klej, należy znieczulić jedno- lub trzytygodniowe muchy o odpowiednim genotypie, schładzając je na lodzie. Pod lunetą sekcyjną podnieś muchę za staw skrzydła i przesuń ją najpierw powierzchnią grzbietową wzdłuż miedzianej siatki, tak aby była zawieszona za szyję. W razie potrzeby obróć muchę, aż będzie patrzeć w dół.

Umieść cienki grzbiet kaktusa przed głową muchy, aby zapobiec jej ucieczce, i umieść kręgosłup przed trąbami, aby się nie poruszał. Przymocuj grzbiet kaktusa do bloku za pomocą wosku pszczelego, upewniając się, że czubek głowy znajduje się na poziomie górnej części bloku. Przymocuj głowę muchy do bloku za pomocą małej kropli kalafonii rozpuszczonej w etanolu.

Umieść blok w nawilżonym pudełku i pozwól kalafonii stwardnieć przez około godzinę. Za pomocą kleszczy pociągnij płytkę anteny do przodu i upuść uchwyt drutu w fałdzie kutykularnym między anteną a głowicą. Przymocuj uchwyt z przodu bloku za pomocą większej ilości wosku pszczelego.

Za pomocą wbudowanych w blok delikatnie popchnij uchwyt przewodu do przodu, aby zrobić trochę miejsca między płytą anteny a głowicą. Umieść osłonę anteny na czubku głowy muchy, tak aby całość była umieszczona centralnie. Przymocuj osłonę do górnej części bloku montażowego za pomocą wosku pszczelego.

Za pomocą rozdzielacza ostrzy wytnij mały otwór w taśmie na tarczy, odsłaniając naskórek głowicy muchy za anteną. Otwór nie powinien wystawać poza oczy, aby zapobiec przeciekaniu preparatu. Uszczelnij otwór między taśmą a naskórkiem dwuskładnikowym silikonem.

Usuń nadmiar silikonu z górnej części głowicy muchy. Umieść kroplę soli fizjologicznej Drosophila ringer na głowie muchy, upewniając się, że nie ma wycieków i że czułki pozostają całkowicie suche. Za pomocą szafirowego ostrza lekko naciąć wzdłuż fałdu skórnego bezpośrednio za anteną.

Następnie przeciąć wzdłuż oczu i w poprzek selli z tyłu. Na koniec złóż kawałek skórki przez naciętą krawędź i odetnij od spodu. Aby uniknąć przecięcia nerwów anteny, ostrożnie usuń gruczoły i tchawicę delikatną pęsetą.

Kilkakrotnie spłucz roztworem dzwonka Drosophila, pozostawiając dużą kroplę na głowie. Włóż celulozową podkładkę do dwumililitrowej plastikowej strzykawki z czystymi kleszkami. Za pomocą końcówki pipety z filtrem nanieś 20 mikrolitrów rozcieńczonego środka zapachowego.

Zatkać i zakryć strzykawkę do momentu, gdy będzie to konieczne do wykonania badania obrazowego. Umieść mocowanie zawierające muchę pod mikroskopem. Opuść obiektyw, aż dotknie roztworu dzwonka na głowie muchy.

Patrząc przez wizjer w świetle jasnego pola, ustaw preparat tak, aby otwór w torebce głowy był wyśrodkowany, a jego brzegi ostre. Przełącz się na światło fluorescencyjne i dostosuj ostrość, aż zobaczysz oznaczone neurony, które powinny być widoczne z podstawowej zielonej fluorescencji GCaMP. Uzyskaj obrazy za pomocą kamery CCD zamontowanej na mikroskopie za pomocą odpowiedniego oprogramowania do akwizycji i znajdź ostrość na interesujących kłębuszkach nerkowych.

Pamiętaj, aby zamknąć przysłonę na ścieżce światła oświetlenia, aby ograniczyć światło wzbudzające do obrazowanego obszaru. Umieść wyjście olfaktometru około 0,5 centymetra przed czułkami much. Tutaj płaty odbytu są pokazane u muchy wyrażającej GCaMP 1.6 pod kontrolą węchowego promotora neuronów czuciowych, który napędza ekspresję w kilku kłębuszkach nerkowych stymulacja 1% kwasem propionowym wywołuje wzrost fluorescencji GAMP wskazującej na wzrost wewnątrzkomórkowego wapnia, w węchowych neuronach czuciowych, kłębuszkach nerkowych, DC cztery i DP jeden L. Pokazano tutaj czasową dynamikę odpowiedzi wapniowych kłębuszków nerkowych DC 4 i DP jednego L na kwas propionowy.

Czarne ślady pokazują medianę średniej delty F nad F w obszarze zainteresowania u ośmiu zwierząt, a szara powierzchnia wskazuje zakres między pierwszym a trzecim kwartylem rozkładu. Poniższe mapy cieplne pokazują reakcje poszczególnych zwierząt. Zielone purpurowe pola wskazują ramki uśrednione w celu obliczenia szczytowych odpowiedzi kłębuszków nerkowych powyżej podstawowych poziomów fluorescencji GCaMP i są pokazane tutaj ilościowo.

Korekta pod kątem wybielania reportera fluorescencyjnego może mieć wpływ na odpowiedź. Dane próbki piku na lewym panelu można skorygować bez większych zmian w kształcie odpowiedzi. Próbka. Korekcja wybielacza ma poważny wpływ na dane na prawym panelu, prawdopodobnie dlatego, że sygnał spada i utrzymuje się poniżej linii bazowej po zakończeniu bodźca zapachowego Po opanowaniu tej techniki można wykonać w około 30 minut.

Jeśli zostanie wykonana prawidłowo Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby antena była całkowicie sucha, w przeciwnym razie nie będzie w stanie wykryć zapachów. Po obejrzeniu tego filmu. Powinieneś dobrze wiedzieć, jak przygotować obraz i przeanalizować zapach.

Wywołaj aktywność neuronalną u muszki owocowej.