Name: Obrazowanie wapniowe reakcji wywołanych zapachem w płacie czułkowym Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Poznaj technikę obrazowania wapniowego reakcji wywołanych zapachem w płacie czułkowym Drosophila melanogaster. Metoda ta umożliwia badanie aktywności neuronów czuciowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pragniemy podziękować Silke Sachse i Beate Eisermann za pomoc w opracowaniu tej metodologii, Pablo Traversie za przygotowanie projektów bloku montażowego oraz Danieli Pelz za udostępnienie schematu zamieszczonego na rysunku 1. Jesteśmy wdzięczni Silke Sachse, Pavan Ramdye i Raphael Rytz za uwagi do manuskryptu. R. Bell otrzymuje wsparcie w ramach stypendium doktoranckiego Boehringer Ingelheim Foundation. Badania w laboratorium R. Bentona są finansowane z grantu European Research Council Starting Independent Researcher oraz przez Swiss National Science Foundation.

1. Montaż bloku mocującego
<ol>
 <li>Blok montażowy z pleksiglasu (Rycina 1A) powinien zostać wykonany zgodnie z dokładnymi specyfikacjami podanymi w schemacie (dostępnym pod adresem 
 <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint</a>), aby umożliwić łatwy montaż i sekcję muchy. Wkręć śruby od tyłu, ale nie wysuwaj ich poza przednią część bloku; ich pozycja zostanie dostosowana podczas przygotowania zwierzęcia (patrz pkt 2.7).</li>
 <li>Za pomocą wiertła precyzyjnego wykonaj wgłębienie w górnej krawędzi okrągłej komory dla muchy, pogłębiając je pod powierzchnią, aby stworzyć miejsce na ciało muchy, zmniejszając w tym punkcie grubość bloku.</li>
 <li>Przetnij skalpelem miedzianą siatkę prostopadle i blisko dna szczeliny, aby utworzyć „kołnierz”. Upewnij się, że dwie powstałe klapy są wyrównane, co ułatwi włożenie muchy.</li>
 <li>Za pomocą wykałaczki nałóż małą kroplę superkleju na blok montażowy nad okrągłą komorą dla muchy. Połóż miedzianą siatkę na kleju i ustaw ją tak, aby szczelina znajdowała się w centrum bloku (Rycina 1A). Delikatnie dociśnij i usuń nadmiar kleju. Za pomocą pęsety dodaj niewielkie krople kleju pod klapami po obu stronach i zagnij siatkę nad przednią częścią bloku tak, aby szczelina była skierowana prosto w dół. Upewnij się, że górna krawędź siatki jest zrównana z blokiem. Pozostaw do całkowitego wyschnięcia.</li>
 <li>Złóż uchwyt drutu: przetnij plastikowe szkiełko podstawne na pół i usuń środkowy fragment, aby uzyskać kształt litery „U”. Użyj wosku pszczelego, aby przykleić odcinek drutu w poprzek górnej części litery „U”; nie napinaj drutu zbyt mocno.</li>
 <li>Wykonaj osłonę antenną: zrób otwór w plastikowym szkiełku podstawnym za pomocą dziurkacza. Przytnij krawędzie szkiełka do wymiarów 0.5 x 0.7 cm. Przyklej perforowane szkiełko do taśmy klejącej, a następnie nanieś kroplę etanolu na taśmę widoczną przez otwór, aby usunąć klej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zwierząt
<ol>
 <li>Muchy o odpowiednim genotypie – tzn. posiadające pożądaną kombinację transgenów „drivera” i reportera aktywności – powinny być w wieku od 1 do 3 tygodni; kutykula młodszych much jest zbyt miękka i trudna do rozcięcia. Gdy eksperymenty wymagają bezpośredniego porównania różnych genotypów, a w celu ujednolicenia poziomów ekspresji transgenów, muchy powinny być w tym samym wieku, aby uniknąć różnic fizjologicznych związanych z wiekiem. Jeśli płeć nie ma znaczenia, zaleca się używanie samic, ponieważ mają one większe głowy i są łatwiejsze w manipulacji.</li>
 <li>Znieczul muchy poprzez schłodzenie na lodzie.</li>
 <li>Wprowadź pojedynczą muchę do bloku montażowego. Trzymając muchę za staw skrzydła, wsuń ją powierzchnią grzbietową wzdłuż szczeliny miedzianej siatki tak, aby zwisała na szyi (Rysunek 1B-C). W razie potrzeby obróć ją, aż będzie skierowana głową w dół.</li>
 <li>Umieść cienki kolec kaktusa przed głową muchy, aby zapobiec jej ucieczce (Rysunek 1B-C). Umieść kolec kaktusa przed trąbką, aby zapobiec jej ruchom. Przymocuj kolec kaktusa do bloku za pomocą wosku pszczelapsed. Upewnij się, że czubek głowy znajduje się na poziomie górnej krawędzi bloku.</li>
 <li>Przymocuj głowę muchy do bloku małą kroplą kalafonii (rozpuszczonej w etanolu). Umieść blok w nawilżonym pojemniku i pozostaw kalafonię do utwardzenia na około jedną godzinę.</li>
 <li>Używając pęsety, odciągnij płytkę antenalną do przodu i umieść drut na uchwycie (stroną woskową na zewnątrz; patrz 1.5) w fałdzie kutykuli między anteną a głową. Przymocuj uchwyt do przodu bloku za pomocą wosku pszczelapsed.</li>
 <li>Używając śrub wbudowanych w blok, delikatnie pchnij uchwyt drutu do przodu, aby stworzyć przestrzeń między płytką antenalną a głową.</li>
 <li>Umieść osłonę antenalną (patrz 1.6) nad głową muchy, pozycjonując otwór centralnie. Przymocuj ją woskiem pszczelapsed do górnej części bloku montażowego.</li>
 <li>Za pomocą noża-dzielnika wytnij mały otwór w taśmie na osłonie, odsłaniając kutykulę głowy muchy za anteną. Otwór nie powinien wykraczać poza oczy, aby zapobiec wyciekom z preparatu.</li>
 <li>Uszczelnij otwór między taśmą a kutykulą silikonem dwuskładnikowym. Usuń nadmiar silikonu z wierzchu głowy muchy.</li>
 <li>Nanieś kroplę soli Ringera dla Drosophila (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 36 mM sacharozy, 5 mM HEPES, pH 7.3) na głowę. Upewnij się, że nie ma wycieków: anteny powinny pozostać całkowicie suche. Używając ostrza szafirowego, przetnij kutykulę. Najpierw lekko nacinaj wzdłuż fałdu kutykuli bezpośrednio za anteną, następnie tnij wzdłuż oczu i przez ocelli z tyłu. Na koniec zagnij fragment kutykuli po naciętej krawędzi i przetnij od spodu, aby uniknąć przecięcia nerwów antenalnych.</li>
 <li>Ostrożnie usuń gruczoły i tchawki za pomocą cienkiej pęsety. Wielokrotnie płucz solą Ringera dla Drosophila, pozostawiając dużą kroplę na głowie.</li>
</ol>
3. Podawanie bodźca zapachowego
<ol>
 <li>Strzykawki zapachowe: za pomocą czystej pęsety umieść wkład z celulozy w plastikowej strzykawce o pojemności 2 ml i nanieś na niego (używając końcówek z filtrem) 20 μl zapachu, rozcieńczonego zgodnie z potrzebą w odpowiednim rozpuszczalniku, przesuwając wkład głęboko do cylindra za pomocą końcówki pipety. Zamknij i zakapsluj strzykawkę do czasu użycia. Świeże rozcieńczenia zapachów należy przygotowywać co najmniej raz na 3 miesiące (lub częściej w przypadku zapachów wysoce lotnych i/lub często używanych), a nowe wkłady do strzykawek zapachowych należy przygotować bezpośrednio przed każdą sesją rejestracyjną. Nie należy używać wkładów zapachowych w więcej niż trzech stymulacjach, ponieważ stężenie zapachu może ulec spadkowi.</li>
 <li>Olfaktometr wykonany na zamówienie (Rycina 2): główny strumień powietrza (1 l/min) jest kierowany przez rurkę teflonową (średnica wewnętrzna 0,4 mm); 27 cm przed wylotem tej rurki dodawany jest pomocniczy strumień powietrza (1 l/min). Oba strumienie powietrza są wytwarzane przez pompy membranowe, a szybkość przepływu jest regulowana przez dwa niezależne przepływomierze. Strumienie powietrza mogą być nawilżane poprzez przepuszczanie ich przez wodę w butelkach myjących gazy, przy czym należy uważać, aby uniknąć nadmiernego nawilżenia (tj. powyżej ~60%). Pomocniczy strumień powietrza jest kierowany albo przez strzykawkę zapachową, albo przez pustą strzykawkę: strzykawki są połączone z przepływem powietrza za pomocą igły strzykawki (średnica zewnętrzna 1,2 mm) przebijającej tłok. Do przełączania między czystym powietrzem a bodźcem zapachowym służy trójdrożny zawór magnetyczny sterowany przez jednostkę sterującą zaworami (np. Harvard Apparatus VC6).</li>
</ol>
4. Obrazowanie in vivo
<ol>
 <li>Opisujemy tutaj obrazowanie przy użyciu pionowego mikroskopu fluorescencyjnego (np. pionowy mikroskop ze stałym stolikiem Zeiss Axio Examiner D1) wyposażonego w obiektyw wodny 20x (np. Zeiss W "Plan-Apochromat" 20x/1,0 M27 DIC) (Rysunek 2). Do obrazowania z użyciem G-CaMP (podbudzenie/emisja: 48/509 nm) należy zastosować blok filtrów o następujących parametrach: filtr podbudzenia 450-490 nm, lustro dichroiczne (T495LP) oraz filtr emisji 50-50 nm (Chroma ET). Umieść blok montażowy z muchą pod mikroskopem. Ustaw wylot olfaktometru w odległości około 0,5 cm przed czułkami muchy.</li>
 <li>Obniż obiektyw, aż dotknie roztworu Ringera na głowie muchy. Patrząc przez okular przy oświetleniu w polu jasnym, ustaw preparat tak, aby otwór w torebce głowy znajdował się w centrum i jego krawędzie były w ostrości. Przełącz na światło fluorescencyjne i reguluj ostrość, aż zobaczysz znakowane neurony (widoczne dzięki podstawowej zielonej fluorescencji G-CaMP).</li>
 <li>Dokonaj precyzyjnego ustawienia ostrości na interesujące kępki (glomeruli), wykonując zdjęcia za pomocą kamery o ładunkach sprzężonych (CCD) (np. system kamery cyfrowej CoolSNAP-HQ2) zamontowanej na mikroskopie, korzystając z odpowiedniego oprogramowania do akwizycji (np. Metafluor) (Rysunek 3A). Przymknij przysłonę w torze światła oświetlającego, aby ograniczyć światło podbudzenia do obrazowanego obszaru.</li>
 <li>Aby zarejestrować aktywność wywołaną zapachem, ustaw częstotliwość akwizycji na 4 Hz i dostosuj czas ekspozycji tak, aby uzyskać wartości fluorescencji w zakresie dynamicznym kamery CCD, lecz nie niższe niż 10 (jednostek arbitralnych), przy rozdzielczości dynamicznej co najmniej 12 bitów. Czas ekspozycji nie powinien przekraczać 100 ms, jeśli to możliwe, aby zredukować fotowyblakanie G-CaMP. Jeśli rozdzielczość przestrzenna kamery na to pozwala, można zwiększyć binning (liczbę studni na chipie, które zostaną połączone w jeden cyfrowy piksel), aby skrócić czas ekspozycji. Uzyskujemy obrazy o wymiarach 350x25 pikseli (przy binningu 2x2), co odpowiada 210x135 μm w preparacie. Ustawienia te są optymalne do rejestracji odpowiedzi kępek indukowanych zapachem dla G-CaMP z dobrą rozdzielczością przestrzenną i czasową, przy jednoczesnym ograniczeniu wyblakania reportera.</li>
 <li>Ustaw parametry pomiaru. Zazwyczaj rejestrujemy sygnał przez 10 sekund (tj. 40 klatek), przy czym stymulacja zapachem rozpoczyna się zazwyczaj 4 sekundy po rozpoczęciu okresu akwizycji (klatka 15) i trwa jedną sekundę (do klatki 19). Preparat z muchy można zazwyczaj przetestować z maksymalnie 25-30 różnymi bodźcami zapachowymi, co często jest ograniczone przez nieodwracalny spadek sygnału fluorescencyjnego reportera w wyniku fotowyblakania. Interwał między bodźcami będzie zależał od obserwowanej siły odpowiedzi oraz tempa fotowyblakania. Odpowiednią długość interwału między bodźcami w celu uniknięcia adaptacji sensorycznej można określić w przybliżeniu poprzez wielokrotną prezentację zapachu kontrolnego dodatniego (jeśli jest znany) w eksperymentach próbnych. Włączanie tego zapachu co około 10 bodźców w danej serii pozwala na weryfikację utrzymania żywotności i spójnej reaktywności preparatu.</li>
</ol>
5. Przetwarzanie i analiza danych
Dane są przetwarzane przy użyciu programu ImageJ (z wtyczką Mac biophotonics, <a href="http://www.macbiophotonics.ca/">www.macbiophotonics.ca</a>) oraz specjalnie napisanych programów w środowiskach Matlab i R w następujący sposób:
<ol>
 <li>Koryguj artefakty wynikające z ruchu próbki: wyrównaj wszystkie obrazy odpowiadające jednej preparacji zwierzęcia (np. 30 pomiarów po 40 klatek każdy), korzystając z trybu „rigid body” wtyczki StackReg/TurboReg (<a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg">bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg</a>) w programie ImageJ. Krok ten jest niezbędny do usunięcia przesunięć pozycji znakowanych neuronów względem ramki akwizycji w obrębie oraz pomiędzy pomiarami. Możliwe jest jednak usunięcie przesunięć jedynie w płaszczyźnie xy. Dane należy odrzucić w przypadku wystąpienia silnych zmian ostrości.</li>
 <li>Podziel stos obrazów na poszczególne 10-sekundowe (40-klatkowe) pomiary.</li>
 <li>Koryguj artefakty wyblaknięcia: ekspozycja na światło fluorescencyjne powoduje spadek fluorescencji podczas pojedynczego pomiaru10. W niektórych przypadkach istotne jest skorygowanie tego spadku przed analizą danych. Dla każdego pomiaru oblicz klatkę tła. Powinna ona stanowić średnią z kilku klatek przed wystąpieniem bodźca (np. klatki 6-14). Podziel każdą klatkę przez tę klatkę tła, aby uzyskać względne zmiany fluorescencji. Oblicz średnią wartość względnej fluorescencji dla każdej klatki, uśredniając wszystkie piksele w obszarze znakowanym przez G-CaMP. Dopasuj funkcję podwójnej wykładniczej do krzywej średniej fluorescencji, nadając większą wagę klatkom przed bodźcem i zerową wagę czasowi odpowiedzi na zapach (w naszym przypadku 20 klatek po wystąpieniu bodźca). Odejmij dopasowaną krzywą od krzywej względnej fluorescencji każdego piksela. Pomnóż skorygowane klatki przez klatkę tła, aby ponownie uzyskać dane surowe. Tego rodzaju korekcja może prowadzić do modyfikacji dynamiki odpowiedzi, jeśli sygnał nie powróci do poziomu bazowego do końca pomiaru (np. w przypadku wywołania odpowiedzi hamujących lub bardzo silnych odpowiedzi pobudzających) (Rysunek 4). Choć korekcja artefaktów wyblaknięcia jest przydatna w wielu przypadkach, interpretacja parametrów czasowych powinna być przeprowadzona z ostrożnością, jeśli zastosowano korekcję wyblaknięcia.</li>
 <li>Oblicz względną zmianę fluorescencji (ΔF/F) dla każdej klatki każdego pomiaru według wzoru (Fi-F0)/F0*10, gdzie F0 to klatka tła (patrz pkt 5.3), a Fi to wartość fluorescencji dla i-tej klatki pomiaru.</li>
 <li>Oblicz średnie ΔF/F w obrębie okrągłego obszaru zainteresowania (ROI) w kłębuszku (Rysunek 3B) o średnicy 10 pikseli, aby uzyskać ślady aktywności (Rysunek 5A). W razie potrzeby przekształć te ślady w mapy ciepła za pomocą programu ImageJ (Rysunek 5A).</li>
 <li>Oblicz amplitudę szczytową odpowiedzi, odejmując średnie ΔF/F z czterech klatek przed stymulacją od średniego ΔF/F z czterech klatek w szczycie odpowiedzi. Tę samą procedurę stosuje się zarówno do ilustrowania przestrzennych wzorców odpowiedzi (patrz Rysunek 3B), jak i do ilościowego określenia amplitudy odpowiedzi w określonych obszarach zainteresowania u różnych much (patrz Rysunek 5B). Szczytową odpowiedź można również określić ilościowo poprzez całkowanie pola pod krzywą w czasie trwania bodźca lub uśrednianie klatek wokół maksimum odpowiedzi.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Powyższe protokoły wykorzystano do rejestracji i analizy odpowiedzi wywołanych kwasem propionowym u muszek wykazujących ekspresję G-CaMP1.628 pod kontrolą promotora koreceptora węchowego IR8a, który jest aktywny w kilku różnych populacjach OSN29,30 (ryciny 3-5). Stymulacja 1% kwasem propionowym wywołuje wzrost fluorescencji G-CaMP – wskazujący na wzrost poziomu wewnątrzkomórkowego wapnia – w OSN unerwiających dwa kłębki, DC4 i DP1l (rycina 3B). Na rycinie 5 przedstawiamy różne sposoby prezentacji danych z wielu muszek: ślady aktywności linii, mapy ciepła oraz wykres słupkowy odpowiedzi szczytowych. Odpowiedzi wywołane kwasem propionowym charakteryzują się odmiennymi amplitudami szczytowymi i dynamiką czasową w kłębkach DC4 i DP1l. Ponadto, choć odpowiedzi są zazwyczaj silne, w obu kłębkach można zaobserwować zmienność między poszczególnymi osobnikami (patrz: mapy ciepła na rycinie 5A). Ilościowe określenie odpowiedzi szczytowych (rycina 5B) umożliwia proste porównanie statystyczne między różnymi kłębkami i różnymi substancjami zapachowymi u różnych zwierząt. Jednak odpowiedzi wapniowe wywołane zapachami mogą wykazywać niejednorodną dynamikę czasową, a określanie ich wielkości za pomocą pojedynczej wartości pomija tę złożoność.
<img alt="Układ eksperymentalny do neurobiologii owadów; schemat z siatką miedzianą, kolcem kaktusa, płatem antenalnym." src="/files/ftp_upload/2976/2976fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat bloku montażowego (A) przed i (B) po wprowadzeniu muchy oraz (C) widok z góry w dużym powiększeniu (zaadaptowano z31).
<img alt="Schemat olfaktometru z źródłem światła, kamerą CCD oraz fluorescencją w płatach antenowych do analizy zapachów." src="/files/ftp_upload/2976/2976fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Schemat układu eksperymentalnego.
<img alt="Odpowiedź płata antenalnego na kwas propionowy, schemat obrazowania wapnia, analiza szczytowej amplitudy %ΔF/F." src="/files/ftp_upload/2976/2976fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3. (A) Widok z góry preparatu muchy po kroku 2.8 (panel lewy) oraz surowy obraz fluorescencyjny płatów antenowych oznakowanych G-CaMP1.6 (Genotyp: Promotor IR8a:GAL4; UAS:G-CaMP1.6). Kłębuszki DC4 i DP1l można odróżnić na podstawie ich morfologii, wielkości oraz położenia; są one zaznaczone odpowiednio kolorem czerwonym i niebieskim. 
(B) Obraz w kolorach przedstawiający odpowiedź na kwas propionowy (1% v/v). Obraz odpowiada wartości ΔF/F dla szczytu odpowiedzi, obliczonej zgodnie z opisem w kroku 5.6 (patrz również Rys. 5A). Skala kolorów po lewej stronie wskazuje wartość %ΔF/F. Czarne okręgi wskazują położenie i rozmiar obszaru zainteresowania (ROI) wykorzystanego do kwantyfikacji odpowiedzi (patrz Rys. 5).
<img alt="Wykres odpowiedzi zapachowej przedstawiający korekcję wybielania, zmianę ΔF/F% oraz porównanie danych w sygnale fluorescencji." src="/files/ftp_upload/2976/2976fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rycina 4. Korekcja wybielania sygnału reportera fluorescencyjnego. Przykłady efektu korekcji wybielania opisanej w kroku 5.3. Dane próbkowania na lewym panelu można skorygować bez znaczących zmian w kształcie odpowiedzi. Dane próbkowania na prawym panelu są w dużym stopniu zmienione przez korekcję wybielania, prawdopodobnie dlatego, że sygnał spada i utrzymuje się poniżej poziomu bazowego po zakończeniu stymulacji zapachowej.
<img alt="Wykresy zmian fluorescencji; analiza odpowiedzi na zapach, DC4 vs DP1l, z amplitudą szczytową ΔF/F %." src="/files/ftp_upload/2976/2976fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 5. (A) Góra: dynamika czasowa odpowiedzi wapniowych kłaczków DC4 (lewo) i DP1l (prawo) na kwas propionowy (1% v/v). Czarne linie przedstawiają medianę średniego ΔF/F w obrębie obszaru zainteresowania (patrz Ryc. 3B) dla ośmiu zwierząt. Szara powierzchnia wskazuje zakres między pierwszym a trzecim kwartylem rozkładu. Przedstawienie wartości mediany i kwartyli dostarcza więcej informacji o zmienności i rozkładzie obserwowanych odpowiedzi niż średnia i błąd standardowy. Zielone i purpurowe ramki wskazują klatki uśrednione w celu obliczenia odpowiedzi szczytowych przedstawionych na Ryc. 3B i ilościowo określonych na Ryc. 5B. Dół: mapy ciepła przedstawiają dane dotyczące odpowiedzi dla wszystkich poszczególnych zwierząt w osobnych rzędach, gdzie wartości ΔF/F są reprezentowane przez skalę kolorystyczną (skrajna prawa strona). Poziome czarne paski wskazują czas i czas trwania bodźca. (B) Mediany odpowiedzi szczytowych na kwas propionowy dla ośmiu zwierząt w kłaczkach DC4 i DP1l. Słupki błędów wskazują zakres między pierwszym a trzecim kwartylem rozkładu.

<ol><li>Galizia, C. G., Rossler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+olfactory+systems+in+insects%3A+anatomy+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Parallel olfactory systems in insects: anatomy and function.</a> Annu. Rev. Entomol. 55, 399-420 (2010).</li>
<li>Vosshall, L. B., Stocker, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Architecture+of+Smell+and+Taste+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular Architecture of Smell and Taste in Drosophila.</a> Annu. Rev. Neurosci. 30, 505-533 (2007).</li>
<li>Wilson, R. I., Mainen, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+events+in+olfactory+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Early events in olfactory processing.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 163-201 (2006).</li>
<li>Masse, N. Y., Turner, G. C., Jefferis, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+information+processing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Olfactory information processing in Drosophila.</a> Curr. Biol. 19, 700-713 (2009).</li>
<li>Hansson, B. S., Anton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+and+morphology+of+the+antennal+lobe%3A+new+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Function and morphology of the antennal lobe: new developments.</a> Annu. Rev. Entomol. 45, 203-231 (2000).</li>
<li>Galizia, C. G., Joerges, J., Kuttner, A., Faber, T., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-in-vivo+preparation+for+optical+recording+of+the+insect+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A semi-in-vivo preparation for optical recording of the insect brain.</a> J. Neurosci. Methods. 76, 61-69 (1997).</li>
<li>Galizia, C. G., Menzel, R., Holldobler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+odor-evoked+glomerular+activity+patterns+in+the+antennal+lobes+of+the+ant+Camponotus+rufipes%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of odor-evoked glomerular activity patterns in the antennal lobes of the ant Camponotus rufipes.</a> Naturwissenschaften. 86, 533-537 (1999).</li>
<li>Okada, K., Kanzaki, R., Kawachi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+voltage-sensitive+dye+imaging+of+an+in+vivo+insect+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">High-speed voltage-sensitive dye imaging of an in vivo insect brain.</a> Neurosci. Lett. 209, 197-200 (1996).</li>
<li>Carlsson, M. A., Knusel, P., Verschure, P. F., Hansson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+Ca2%2B+dynamics+of+moth+olfactory+projection+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal Ca2+ dynamics of moth olfactory projection neurones.</a> The European journal of neuroscience. 22, 647-657 (2005).</li>
<li>Galizia, C. G., Vetter, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGalizia%2C+CG+%22Methods+in+Insect+Sensory+Neuroscience+%28Frontiers+in+Neuroscience%29%22">Methods in Insect Sensory Neuroscience (Frontiers in Neuroscience)</a>. Christensen, T. A. 13, CRC Press. 349-392 (2005).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li>
<li>Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li>
<li>Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+quantitative+Ca2%2B+measurements+using+improved+cameleons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 2135-2140 (1999).</li>
<li>Martin, J. R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brulet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+Ca+signalling+in+the+brain+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of Ca signalling in the brain of Drosophila.</a> PLoS One. 2, 275-275 (2007).</li>
<li>Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+Ca2%2B+stores+contribute+to+odor-induced+responses+in+Drosophila+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons.</a> The Journal of Experimental Biology. 213, 4163-4173 (2010).</li>
<li>Yuste, R., Miller, R. B., Holthoff, K., Zhang, S., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapto-pHluorins%3A+chimeras+between+pH-sensitive+mutants+of+green+fluorescent+protein+and+synaptic+vesicle+membrane+proteins+as+reporters+of+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Synapto-pHluorins: chimeras between pH-sensitive mutants of green fluorescent protein and synaptic vesicle membrane proteins as reporters of neurotransmitter release.</a> Methods Enzymol. 327, 522-546 (2000).</li>
<li>Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+specificity+in+Drosophila+pheromone+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and specificity in Drosophila pheromone perception.</a> Trends Neurosci. 30, 512-519 (2007).</li>
<li>Elliott, D. A., Brand, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GAL4+system+%3A+a+versatile+system+for+the+expression+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The GAL4 system : a versatile system for the expression of genes.</a> Methods Mol. Biol. 420, 79-95 (2008).</li>
<li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat. Neurosci. 9, 703-709 (2006).</li>
<li>Yagi, R., Mayer, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refined+LexA+transactivators+and+their+use+in+combination+with+the+Drosophila+Gal4+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Refined LexA transactivators and their use in combination with the Drosophila Gal4 system.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16166-16171 (2010).</li>
<li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Q+System%3A+A+Repressible+Binary+System+for+Transgene+Expression%2C+Lineage+Tracing%2C+and+Mosaic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Q System: A Repressible Binary System for Transgene Expression, Lineage Tracing, and Mosaic Analysis.</a> Cell. 141, 536-548 (2010).</li>
<li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112, 271-282 (2003).</li>
<li>Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+expressed+cameleon+in+Drosophila+melanogaster+is+used+to+visualize+olfactory+information+in+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically expressed cameleon in Drosophila melanogaster is used to visualize olfactory information in projection neurons.</a> Curr. Biol. 12, 1877-1884 (2002).</li>
<li>Ng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+olfactory+information+between+three+populations+of+neurons+in+the+antennal+lobe+of+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly.</a> Neuron. 36, 463-474 (2002).</li>
<li>Sachse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+plasticity+in+an+olfactory+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent plasticity in an olfactory circuit.</a> Neuron. 56, 838-850 (2007).</li>
<li>Pelz, D., Roeske, T., Syed, Z., de Bruyne, M., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+receptive+range+of+an+olfactory+receptor+in+vivo+%28Drosophila+melanogaster+Or22a%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The molecular receptive range of an olfactory receptor in vivo (Drosophila melanogaster Or22a).</a> J. Neurobiol. 66, 1544-1563 (2006).</li>
<li>Silbering, A. F., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+odor+mixtures+in+the+Drosophila+antennal+lobe+reveals+both+global+inhibition+and+glomerulus-specific+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Processing of odor mixtures in the Drosophila antennal lobe reveals both global inhibition and glomerulus-specific interactions.</a> J. Neurosci. 27, 11966-11977 (2007).</li>
<li>Reiff, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li>
<li>Abuin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+olfactory+ionotropic+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of olfactory ionotropic glutamate receptors.</a> Neuron. 69, 44-60 (2011).</li>
<li>Benton, R., Vannice, K. S., Gomez-Diaz, C., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+ionotropic+glutamate+receptors+as+chemosensory+receptors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Variant ionotropic glutamate receptors as chemosensory receptors in Drosophila.</a> Cell. 136, 149-162 (2009).</li>
<li>Pelz, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Functional+characterization+of+Drosophila+melanogaster+Olfactory+Receptor+Neurons%22">Functional characterization of Drosophila melanogaster Olfactory Receptor Neurons</a>. , Freien Universitat Berlin. (2005).</li>
<li>Ai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid+sensing+by+the+Drosophila+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Acid sensing by the Drosophila olfactory system.</a> Nature. 468, 691-695 (2010).</li>
<li>Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Brain+Imaging%3A+Fluorescence+or+Bioluminescence%2C+Which+to+Choose%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">In Vivo Brain Imaging: Fluorescence or Bioluminescence, Which to Choose?</a> Journal of Neurogenetics. , 1-23 (2008).</li>
<li>Jayaraman, V., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+a+genetically+encoded+optical+sensor+of+neural+activity+using+electrophysiology+in+intact+adult+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies.</a> Front. Neural Circuits. 1, 3-3 (2007).</li>
<li>Pfeiffer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9715-9720 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Opisane tutaj metody preparowania i analizy mogą być wykorzystane do badania odpowiedzi wywołanych zapachami w dowolnej populacji neuronów w płacie antenalnym (OSNs, LN i PNs), dla której dostępny jest odpowiedni transgen sterujący. Choć opisujemy zastosowanie tej metody z użyciem mikroskopu fluorescencyjnego, obrazowanie optyczne tego preparatu można równie dobrze przeprowadzić za pomocą mikroskopii konfokalnej lub dwufotonowej22,32. Instrumenty te eliminują problem rozpraszania światła występujący w mikroskopii szerokopolowej, co może obniżać rozdzielczość obrazów, zwłaszcza gdy reporter jest ekspresjonowany przez dużą liczbę neuronów. Preparat ten zazwyczaj pozwala na rejestrację odpowiedzi wywołanych zapachami przez co najmniej pół godziny, jednak czas ten może być znacznie dłuższy lub krótszy w zależności od liczby i czasu trwania rejestrowanych pomiarów, czasu ekspozycji dla każdej klatki oraz odstępu między bodźcami. Ponadto wzbudzenie dwufotonowe może ograniczyć fotoblaknięcie reportera fluorescencyjnego, a także fototoksyczność komórkową, co pozwala na prowadzenie pomiarów przez dłuższe okresy czasu22,32.
Niezależnie od wyboru mikroskopu, ruch mózgu muchy wewnątrz kapsuły głowowej jest najczęstszym problemem podczas obrazowania w nienaruszonych zwierzętach. Chociaż korekcja ruchu może rozwiązać drobne problemy (krok 5.1), zazwyczaj lepiej jest rejestrować dane wyłącznie z bardzo stabilnych preparatów. Strategie ograniczające artefakty ruchowe obejmują: (i) odpowiednie unieruchomienie trąbki muchy za pomocą kolca kaktusa; (ii) unieruchomienie nóg muchy poprzez przymocowanie ich do stolika eikosanem (przed krokiem 2.6) (eikosan można stopić w temperaturze ~37 °C; w tym celu należy użyć srebrnego drutu, aby wydłużyć i zwęzić końcówkę lutownicy); (iii) nacięcie przełyku (widocznego pomiędzy nerwami czułkowymi) za pomocą cienkiej pęsety.
Oprócz zastosowanego tutaj G-CaMP1.6 dostępnych jest wiele zoptymalizowanych wersji G-CaMP oraz innych wskaźników wapnia, które różnią się stosunkiem sygnału do szumu, fluorescencją bazową i dynamiką czasową12,28,33. Precyzyjny wybór sensora powinien uwzględniać wszystkie te właściwości, rodzaj analizowanych neuronów oraz badane zagadnienie biologiczne. Obecne sensory raportują zmiany poziomu wapnia, które dość dobrze korelują z potencjałami czynnościowymi12,34, a ich dalsze udoskonalanie, w połączeniu z rosnącą liczbą specyficznych genetycznych linii sterujących35, będzie nadal zwiększać potencjał obrazowania optycznego aktywności neuronalnej w nienaruszonej muszce.

<table><tbody><tr><td>Kolec kaktusa</td><td>Centrum ogrodnicze</td><td></td><td>~7 mm długości, cienki, niezbyt elastyczny</td></tr><tr><td>Kalafonia</td><td>Sklep z instrumentami strunowymi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dwuskładnikowy silikon</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>KWIK-SIL</td><td></td></tr><tr><td>Niestandardowy pleksiglasowy blok montażowy</td><td><a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Dostępne schematy</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siatki miedziane</td><td>Siatki Athene</td><td>G20-5</td><td>Zazwyczaj stosowane do próbek do mikroskopii elektronowej.</td></tr><tr><td>Śruby</td><td>Sklep z artykułami budowlanymi</td><td></td><td>średnica 2 mm</td></tr><tr><td>Plastikowe szkiełka nakrywki</td><td>Plano GmbH</td><td>L4193</td><td>2 x 2 mm</td></tr><tr><td>Głowice lutownicze</td><td>Conrad Electronics</td><td>830283-62</td><td></td></tr><tr><td>Stabilizowany zasilacz</td><td>Conrad Electronics</td><td>511407-62</td><td></td></tr><tr><td>Cienki drut</td><td>Isabellenh&amp;#252;tte</td><td>Isa-ohm</td><td>0,013 mm</td></tr><tr><td>Eikosan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21,927-4</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Axioexaminer D1</td><td></td></tr><tr><td>kamera CCD</td><td>Visitron Systems</td><td>CoolSnap HQ</td><td></td></tr><tr><td>Metafluor</td><td>Systemy Visitron</td><td></td><td>Oprogramowanie do akwizycji danych</td></tr><tr><td>Monochromator</td><td>Visitron Systems</td><td>Visichrome</td><td></td></tr><tr><td>Łamliwe ostrza</td><td>Fine Science Tools</td><td>10050-00</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do ostrza</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14134</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze szafirowe</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500314</td><td>Ostrze dwustronne 1 mm</td></tr><tr><td>Membranowe pompy gazowe</td><td>KNF Neuberger</td><td>NMP 830 KVE</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do ostrzy szafirowych</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500317</td><td></td></tr><tr><td>Zawór trójdrożny</td><td>Lee Company</td><td>LFAA12018H</td><td>Konfiguracja E</td></tr><tr><td>Rotametr 50 ml/min</td><td>Analyt-MTC</td><td>12-08SA</td><td></td></tr><tr><td>Rotametr 5 l/min</td><td>Analyt-MTC</td><td>102-08SA</td><td></td></tr><tr><td>Wosk pszczeli</td><td>Technika Siladent</td><td>209212</td><td></td></tr><tr><td>Wkład z celulozy</td><td>Kettenbach</td><td>31003</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Plano GmbH</td><td>T5130</td><td>Biologia Dumont #5</td></tr><tr><td>Strzykawki</td><td>BD Biosciences</td><td>300928</td><td>2 ml, Discardit II, 2 sztuki</td></tr><tr><td>Igły</td><td>Braun Sterican</td><td>4665120</td><td>1,2 mm średnicy zewnętrznej</td></tr></tbody></table>

obrazowanie wapniowe odpowiedzi wywołanych zapachami w płacie antennym drosophila

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Płatek czułkowy jest głównym centrum węchowym w mózgu owadów i stanowi anatomiczny oraz funkcjonalny odpowiednik opuszki węchowej kręgowców1-5. Informacje węchowe ze świata zewnętrznego są przekazywane do płatka czułkowego przez sensoryczne neurony węchowe (OSNs), które segregują się do odrębnych obszarów neuropila zwanych kłębuszkami, w zależności od specyficznego receptora węchowego, który eksponują. Tutaj aksony OSN tworzą synapsy zarówno z lokalnymi neuronami interneuronami (LNs), których wypustki mogą unerwiać wiele różnych kłębuszków, jak i z neuronami projekcyjnymi (PNs), które przekazują informacje węchowe do wyższych ośrodków węchowych mózgu.
Obrazowanie optyczne aktywności OSN, LN i PN w płacie antennym – tradycyjnie z wykorzystaniem syntetycznych wskaźników wapnia (np. calcium green, FURA-2) lub barwników wrażliwych na napięcie (np. RH414) – od dawna stanowi ważną technikę pozwalającą zrozumieć, w jaki sposób bodźce zapachowe są reprezentowane jako przestrzenne i czasowe wzorce aktywności kłębków u wielu gatunków owadów6-10. Opracowanie genetycznie kodowanych reporterów aktywności neuronalnej, takich jak fluorescencyjne wskaźniki wapnia G-CaMP11,12 i Cameleon13, bioluminescencyjny wskaźnik wapnia GFP-aequorin14,15 lub reporter transmisji synaptycznej synapto-pHluorin16, sprawiło, że układ węchowy muszki owocówki, Drosophila melanogaster, stał się szczególnie podatny na obrazowanie neurofizjologiczne, co uzupełnia jej kompleksowo opisane właściwości molekularne, elektrofizjologiczne i neuroanatomiczne2,4,17. Reportery te mogą być selektywnie ekspresowane za pomocą binarnych systemów kontroli transkrypcyjnej (np. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, system Q21) w określonych populacjach neuronów w obrębie obwodów węchowych, aby z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową przeanalizować, w jaki sposób wywołana zapachami aktywność neuronalna jest reprezentowana, modulowana i przekształcana22-24.
Opisujemy tutaj metody przygotowania i analizy służące do pomiaru odpowiedzi wywołanych zapachami w płacie antennalnym Drosophila z wykorzystaniem G-CaMP25-27. Przygotowanie zwierzęcia jest małoinwazyjne i może być dostosowane do obrazowania z użyciem fluorescencji w szerokim polu, mikroskopii konfokalnej oraz dwufotonowej.

Opisujemy uznaną technikę pomiaru i analizy odpowiedzi wapniowych wywołanych zapachami w płacie antennym żywych Drosophila melanogaster.

Obrazowanie wapniowe odpowiedzi wywołanych zapachami w płacie antennym Drosophila

Płat antenny jest głównym ośrodkiem węchowym w mózgu owada i stanowi anatomiczny oraz funkcjonalny odpowiednik opuszki węchowej kręgowców...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar aktywności fizjologicznej neuronów węchowych w drosophila oraz w płacie antenalnym poprzez obrazowanie optyczne wewnątrzkomórkowych zmian poziomu wapnia. W tym celu w pierwszej kolejności należy zmontować uchwyt drutu bloku montażowego oraz osłonę anteny. Następnie muszka wykazująca ekspresję fluorescencyjnego czujnika wapnia GCaMP zostaje zamocowana i unieruchomiona w bloku.Po unieruchomieniu muchy wycina się kutykulę z górnej części głowy, aby odsłonić płaty antenowe. Ostatnim krokiem procedury jest umieszczenie muchy pod mikroskopem i stymulacja jej zapachem. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące wzorce aktywności wywołane zapachem w płatach antenowych DLA poprzez zapisane zmiany względnej fluorescencji sensora wapnia G camp.Niniejsza metoda może pomóc w wyjaśnieniu, w jaki sposób zapachy są reprezentowane jako przestrzenne i czasowe wzorce aktywności neuronalnej na różnych poziomach obwodów węchowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak elektrofizjologia, jest możliwość rejestracji aktywności genetycznie zidentyfikowanych neuronów, które nie są dostępne dla elektrod rejestrujących. Dzięki temu metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat neuronalnego przetwarzania zapachów.Metodę tę można zastosować również w innych obszarach mózgu joof, takich jak systemy słuchowy i węchowy. Najpierw przełóż śruby przez tył pleksiglasowego bloku montażowego w taki sposób, aby nie wystawały poza jego przednią krawędź. Używając wiertarki precyzyjnej, wykonaj wgłębienie w górnej krawędzi okrągłej komory dla muchy, drążąc pod powierzchnią w celu zmniejszenia grubości bloku.Pod mikroskopem stereoskopowym należy skalpelem przeciąć miedzianą siatkę prostopadle i blisko dna szczeliny, aby utworzyć kołnierz do utrzymania muchy. Należy upewnić się, że obie powstałe zakładki są wyrównane, co ułatwi umieszczenie muchy. Za pomocą wykałaczki nałożyć małą kroplę superkleju na blok montażowy nad okrągłą komorą.W przypadku muchy, należy położyć miedzianą siatkę na kleju i ustawić ją tak, aby szczelina znajdowała się na środku bloku. Delikatnie dociśnąć siatkę i usunąć nadmiar kleju za pomocą pęsety. Nanieść małe krople kleju pod zakładki po każdej stronie i zagiąć siatkę nad przodem bloku w taki sposób, aby szczelina była skierowana prosto w dół.Upewnij się, że góra siatki jest zrównana z blokiem i pozostaw ją do całkowitego wyschnięcia. Aby wykonać uchwyt do drutu, przetnij szkiełko podstawkowe na pół i usuń środkowy fragment, tworząc kształt litery U. Użyj wosku pszczelego, aby przykleić kawałek drutu w poprzek górnej części litery U, tak aby drut nie był zbyt naciągnięty.Wykonaj osłonę anteny, używając dziurkacza do papieru w celu wykonania otworu w plastikowym szkiełku nakrywce. Przytnij krawędzie szkiełka do wymiarów 0,5 na 0,7 centymetrów. Przyklej perforowane plastikowe szkiełko do taśmy klejącej, a następnie nanieś kroplę etanolu na taśmę widoczną przez otwór.Aby usunąć klej, znieczulone muchy w wieku od jednego do trzech tygodni o odpowiednim genotypie należy schłodzić na lodzie. Pod mikroskopem stereoskopowym chwyć muchę za staw skrzydła i przesuń ją grzbietem wzdłuż miedzianej siatki w taki sposób, aby została zawieszona na szyi. W razie potrzeby obróć muchę tak, aby była skierowana w dół.Umieść cienki kolec kaktusa przed głową muchy, aby zapobiec jej ucieczce, i wypozycjonuj kolec przed cycumłą, aby unieruchomić ją w jednej pozycji. Przymocuj kolec kaktusa do bloku za pomocą wosku pszelego, upewniając się, że szczyt głowy znajduje się na poziomie górnej krawędzi bloku. Przymocuj głowę muchy do bloku za pomocą małej kropli kalafonii rozpuszczonej w etanolu.Umieść blok w wilgotnej komorze i pozostaw kalafonię do stwardnienia na około jedną godzinę. Za pomocą pincety odciągnij płytkę czułka do przodu i umieść uchwyt drutu w fałdzie kutykuli między czułkiem a głową. Przymocuj uchwyt do przodu bloku, używając dodatkowego wosku pszelego.Używając wkrętów wbudowanych w blok, delikatnie przesuń uchwyt drutu do przodu, aby stworzyć przestrzeń między płytką anteny a głową. Umieść osłonę anteny na górnej części głowy muchy, pozycjonując całość centralnie. Przymocuj osłonę do górnej części bloku montażowego za pomocą wosku pszczelego.Używając rozdzielacza ostrzem, wytnij mały otwór w taśmie na osłonie, odsłaniając kutykulę głowy muchy za czułkiem. Otwór nie powinien sięgać poza oczy, aby zapobiec wyciekowi preparatu. Uszczelnij otwór między taśmą a kutykulą za pomocą dwuskładnikowego silikonu.Usuń nadmiar silikonu z górnej części głowy muchy. Nanieś kroplę soli fizjologicznej Ringer dla drozofili na głowę muchy, upewniając się, że nie ma wycieków i że czułki pozostają całkowicie suche. Używając ostrza szafirowego, wykonaj delikatne nacięcie wzdłuż fałdy kutykularnej bezpośrednio za czułkiem.Następnie wykonaj nacięcia wzdłuż oczu oraz w poprzek selli na grzbiecie. Na koniec zegnij fragment kutykuli wzdłuż naciętej krawędzi i przetnij go od spodu. Aby uniknąć przerwania nerwów czułkowych, ostrożnie usuń gruczoły i tchawki za pomocą precyzyjnej pęsety.Wielokrotnie przemyj roztworem Ringera dla Drosophila, pozostawiając dużą kroplę na głowie. Za pomocą czystej pęsety włóż wkład z celulozy do plastikowej strzykawki o pojemności dwóch mililitrów. Używając końcówki do pipety z filtrem, nanieś 20 µL rozcieńczonego substancji zapachowej.Zatkać i zakryć strzykawkę aż do momentu rozpoczęcia obrazowania. Umieścić uchwyt z muchą pod mikroskopem. Obniżyć obiektyw, aż zetknie się on z roztworem Ringera na głowie muchy.Patrząc przez okular przy oświetleniu w polu jasnym, ustaw preparat tak, aby otwór w torebce głowowej znajdował się w centrum, a jego krawędzie były w ostrości. Przełącz na światło fluorescencyjne i reguluj ostrość, aż zobaczysz znakowane neurony, które powinny być widoczne dzięki podstawowej zielonej fluorescencji GCaMP. Wykonaj obrazy za pomocą kamery CCD zamontowanej na mikroskopie, używając odpowiedniego oprogramowania do akwizycji, a następnie ustaw ostrość na interesujące Cię kłębki.Należy upewnić się, że przysłona w torze oświetlenia jest przymknięta, aby ograniczyć światło wzbudzenia do obszaru obrazowania. Wylot olfaktometru należy ustawić w odległości około 0,5 cm przed czułkami much. Tutaj pokazano płaty analne u muchy wykazującej ekspresję GCaMP 1.6 pod kontrolą promotora neuronów sensorycznych węchu, który steruje ekspresją w kilku kłębach; stymulacja 1% kwasem propionowym wywołuje wzrost fluorescencji GCaMP, co wskazuje na wzrost poziomu wapnia wewnątrzkomórkowego w neuronach sensorycznych węchu unerwiających kłęby DC four i DP one L. Tutaj przedstawiono dynamikę czasową odpowiedzi wapniowej kłębów DC four i DP one L na kwas propionowy.Czarne linie przedstawiają medianę średniego delta F nad F w obrębie obszaru zainteresowania dla ośmiu zwierząt, a szara powierzchnia wskazuje zakres między pierwszym a trzecim kwartylem rozkładu. Mapy ciepła poniżej przedstawiają odpowiedzi poszczególnych zwierząt. Zielone i magenta ramki wskazują klatki uśrednione w celu obliczenia odpowiedzi szczytowych kłębków powyżej poziomu fluorescencji bazowej GCaMP, które zostały tutaj ilościowo określone.Korekta efektu blaknięcia fluorescencyjnego reportera może wpływać na charakter odpowiedzi. Dane szczytowe w panelu po lewej stronie można skorygować bez istotnych zmian w kształcie odpowiedzi. Dane w panelu po prawej stronie są w znacznym stopniu zaburzone przez korektę blaknięcia, prawdopodobnie dlatego, że sygnał spada i utrzymuje się poniżej linii bazowej po zakończeniu stymulacji zapachowej. Po opanowaniu techniki, procedura ta zajmuje około 30 minut.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby utrzymać anteny w całkowitej suchości; w przeciwnym razie nie będą one w stanie wykryć zapachów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przygotować obraz i analizować zapach.Wywołaj aktywność neuronalną u muszki owocowej.

calcium-imaging-odor-evoked-responses-drosophila-antennal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Obrazowanie wapnia wskazujące na reakcje wywołane przez zapach w czułkowym płacie Drosophila

Pszczoły można poddać warunkowaniu w paradygmacie apetytywnego uczenia się węchowego (warunkowanie PER). Wykorzystując zapachy jako bodźce, opracowaliśmy metodę, w której rejestrowane jest zachowanie, przy jednoczesnym zastosowaniu obrazowania wapniowego w celu pomiaru aktywności wywołanej zapachem w neuronach ciała grzybowatego in vivo.

In vivo obrazowanie Ca2+ neuronów ciał grzybowych podczas uczenia się zapachów u pszczoły miodnej

Ten film opisuje obrazowanie in vivo wapnia w neuronach Drosophila za pomocą GCaMP. Prezentowany klip protokołu pokazuje, jak rejestrować zmiany we fluorescencji GCaMP z neuronów ciała grzyba podczas eksperymentu kondycjonowania węchowego.

Drosophila In Vivo (Drosophila) in vivo (Drosophila) Obrazowanie wapnia: metoda funkcjonalnego obrazowania aktywności neuronalnej

Ten film demonstruje metodę wykrywania reakcji neuronów czuciowych u Drosophila za pomocą wiązania ligandów i obrazowania fluorescencyjnego. Ligandy wiążą się z receptorami neuronów, powodując napływ wapnia. Wapń wiąże się z kompleksami wskaźnikowymi, co prowadzi do emisji fluorescencji, która potwierdza odpowiedź neuronalną na ligand.

Wykrywanie reakcji fizjologicznych neuronów czuciowych u Drosophila

Ten film demonstruje metodę obrazowania wapnia in vivo za pomocą synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia u muszek. Przedstawia etapy przygotowania muszek do mikroskopii, przeprowadzania kondycjonowania węchowego i wizualizacji napływu wapnia wywołanego zapachem.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia za pomocą synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia u Drosophila melanogaster

Źródło: Ishimoto, H. et. al.,, Obrazowanie wapnia ex vivo do wizualizacji reakcji mózgu na sygnalizację endokrynologiczną u Drosophila. J. Vis. exp. (2018) Ten film przedstawia obrazowanie wapnia do badaniaDrosophila reakcje mózgu na neuropeptydy. Neurony wyrażające fluorescencyjny wskaźnik wapnia ujawniają wewnątrzkomórkową dynamikę wapnia i funkcjonalne odpowiedzi na cząsteczki sygnałowe.

Obrazowanie wapnia ex vivo w celu zbadania reakcji mózgu Drosophila na neuropeptydy

Przednie nogi i trąbka Drosophila zawierają bogaty repertuar smakowych neuronów czuciowych. W tym artykule przedstawiono metodę wykorzystującą obrazowanie wapnia do pomiaru fizjologicznych odpowiedzi neuronów czuciowych w przedniej nodze i trąbce żywych much po egzogennym zastosowaniu feromonu smakowego.

Pomiar fizjologicznych reakcji neuronów czuciowych Drosophila na feromony lipidowe za pomocą obrazowania wapnia na żywo

Ten artykuł opisuje adaptowalny protokół ex vivo do wizualizacji Ca2+ podczas aktywacji jaj u Drosophila.

Obrazowanie wapnia u Drosophila podczas aktywacji jaj

Tutaj prezentujemy protokół, za pomocą którego można wizualizować wapń pre- i/lub postsynaptyczny w kontekście uczenia się i zapamiętywania Drosophila. Obrazowanie wapnia in vivo przy użyciu synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia jest połączone z klasycznym paradygmatem warunkowania węchowego, dzięki czemu można określić plastyczność synaptyczną leżącą u podstaw tego typu uczenia się asocjacyjnego.

Optyczne obrazowanie wapnia in vivo plastyczności synaptycznej indukowanej uczeniem się u Drosophila melanogaster

Podejście do obrazowania wapnia umożliwia rejestrowanie reakcji wywołanych smakiem w mózgach obudzonych muszek, podczas gdy roztwór jest nakładany na labellum. Jako przykład podano pierwotne reakcje smakowe u Drosophila melanogaster, ale protokół ten można dostosować do badania neuronów w dół rzeki lub innych gatunków.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia reakcji neuronalnych wywołanych smakiem u dorosłych Drosophila

Istotną przeszkodą w badaniu aktywności komórkowej podczas procesów poznawczych, takich jak uczenie się i pamięć, jest stosowanie środków znieczulających do przygotowania obrazowania in vivo. Znieczulenie upośledza pamięć krótkotrwałą i funkcje poznawcze w wielu modelach, w tym u Drosophila. W pracy przedstawiono unikalną metodę przygotowania dorosłej Drosophila do obrazowania in vivo bez znieczulenia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie aktywności neuronalnej u nieznieczulonych dorosłych much Drosophila

Przedstawiamy protokoły obrazowania wapnia dla larwalnego neuronu węchowego Drosophila , wykorzystując miejscowy klej tkankowy do unieruchomienia. Ta metoda zwiększa stabilność, ułatwiając wiarygodne eksperymenty in vivo i ex-vivo . Niestandardowe skrypty R analizują sygnały wapnia, zapewniając efektywną platformę do szczegółowych badań neurofizjologicznych.

Obrazowanie wapnia in vivo i ex vivo neuronu obwodu węchowego u larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium

Poznaj technikę obrazowania wapniowego reakcji wywołanych zapachem w płacie czułkowym Drosophila melanogaster. Metoda ta umożliwia badanie aktywności neuronów czuciowych w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie wapniowe odpowiedzi wywołanych zapachami w płacie antennym Drosophila

Przeglądaj więcej filmów