Okienkowanie jaj: metoda otwierania zapłodnionej skorupki jaja kurzego w celu odsłonięcia naczyń naczyniowych błony moczowo-omoczniowej

W zapłodnionym jaju kurzym błona kosmówkowo-omoczniowa lub CAM jest silnie unaczynioną warstwą znajdującą się poniżej wewnętrznej błony skorupki jaja. Działa wspomagająco rozwój zarodka.

Aby odsłonić w pełni rozwinięty CAM, zacznij od umieszczenia świecy do jajek - jasnego źródła światła - przy skorupce jajka, aby uwidocznić wnętrze jajka. Zlokalizuj komórkę powietrzną między zewnętrzną i wewnętrzną błoną skorupki jaja a widocznym rozgałęzionym naczyniem w jaju. Oznacz ich pozycje na zewnątrz.

W tych miejscach wykonaj małe okrągłe otwory w skorupce jajka, aby odsłonić leżącą pod spodem białą błonę skorupy. Delikatnie przebij odsłoniętą membranę w obu miejscach, nie przerywając CAM ani nie powodując wycieku albuminy lub krwi.

Trzymając jajo wzdłużnie, zastosuj ssanie nad naturalnym otworem komórki powietrznej, aby usunąć powietrze z wnętrza. Powstałe podciśnienie obniża CAM poniżej drugiego otworu, generując sztuczną komórkę powietrzną nad siecią naczyniową.

Nakreśl przeniesioną komórkę powietrzną. Przeciąć skorupkę jajka, kilka centymetrów w głąb konturu, nie naruszając granicy komórka powietrzna-CAM. Usuń naciętą skorupę, aby utworzyć duże okno, odsłaniając leżącą pod spodem CAM i układ krążenia. Użyj przezroczystej folii, aby uszczelnić okno na żywotnych jajach.

W 7 lub 8 dniu rozwoju, kiedy CAM jest w pełni rozwinięty, wyłącz rotator jaj i umieść około 1 do 3 jaj w stojaku na jajka w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przy zgaszonych światłach umieść świecę do jajka przy skorupce jajka, aby zidentyfikować i zaznaczyć położenie komórki powietrznej jednego jajka. Następnie przesuń świecę do jajek po skorupce, aby znaleźć dużą sieć naczyń krwionośnych, obracając jajko w razie potrzeby.

Idealne unaczynienie rozgałęzi się w pobliżu środka jaja. Użyj markera, aby prześledzić naczynia krwionośne, które mają być użyte do implantacji. Po ponownym włączeniu światła w masce użyj bezprzewodowego narzędzia obrotowego wyposażonego w kamień szlifierski z węglika krzemu, aby wywiercić mały otwór w skorupie bezpośrednio nad środkiem komory powietrznej. Gdy większość skorupy zostanie usunięta, ale z nienaruszoną białą, wewnętrzną membraną, wywierć kolejny mały otwór, w którym okno naczyniowe zostanie otwarte, jak pokazano. Gdy drugi otwór jest gotowy, użyj igły o rozmiarze 18, aby delikatnie przebić białą błonę wewnętrzną nad komórką powietrzną i naczyniami krwionośnymi, uważając, aby biała, wewnętrzna membrana, ale nie CAM, została przerwana na całym wierconym obszarze.

Przy ponownie wyłączonym świetle kaptura użyj świecznika do jajek, aby sprawdzić, czy komórka powietrzna została przeniesiona z końca jajka do obszaru nad naczyniami krwionośnymi. W razie potrzeby umieść rurkę próżniową włożoną do kontrolera pipet wokół otworu nad oryginalną komórką powietrzną i delikatnie zasysaj w krótkich seriach, aby przesunąć komórkę powietrzną. Zaznacz kontur nowego położenia komory powietrznej, około 0,5 centymetra wewnątrz granicy powietrze-CAM, i przymocuj kawałek taśmy pakowej wystarczająco duży, aby zakryć otwór nad nową komórką powietrzną.

Po przygotowaniu pozostałych dwóch jaj, jak właśnie pokazano, należy umieścić jaja z powrotem w inkubatorze i otworzyć wszelkie dodatkowe jaja do eksperymentu w grupach od 1 do 3, jak pokazano. Po otwarciu wszystkich jaj przenieś od 1 do 3 jaj z przeniesionymi komórkami powietrznymi do stojaka na jajka w szafie bezpieczeństwa biologicznego i użyj bezprzewodowego narzędzia obrotowego wyposażonego w okrągłą tarczę tnącą, aby całkowicie przeciąć małą linię nad granicą komórek powietrznych przez komórkę bez zakłócania CAM lub układu naczyniowego. Za pomocą zakrzywionych nożyczek przeciąć pozostałą komórkę powietrzną, aby utworzyć okno w skorupie i sprawdzić żywotność zarodka.

Zdolne do życia zarodki będą wykazywać rozległe unaczynienie, wyraźne białko, ruchy zarodka i/lub widoczne bicie serca. U zarodków niezdolnych do życia CAM może wydawać się nieprzezroczysty z niewielką liczbą naczyń krwionośnych, jeśli w ogóle, a zarodki mogą być małe lub nieobecne, bez ruchu lub bicia serca. Za pomocą kleszczyków Semken wyciągnij małe kawałki bawełny ze sterylnego wacika i delikatnie osusz powierzchnię CAM żywotnych zarodków, aby usunąć kurz i zanieczyszczenia z muszli. Następnie przykryj otwór skorupy jedną czwartą kawałka przezroczystego folii o wymiarach 6 na 7 centymetrów, nie dotykając CAM, i włóż jaja z powrotem do inkubatora z otwartym okienkiem skierowanym do góry. Użyj kawałka stojaka na jajka, krawędzi rotatora do jaj lub innego odpowiedniego przedmiotu, aby podeprzeć jajka, które się toczą.