JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:26 min. • April 30th, 2023
Błona kosmówkowo-omocznaniowa kurczaka lub CAM jest wysoce unaczynioną błoną znajdującą się w jajach niektórych kręgowców, takich jak kurczaki. Ta błona pozaembrionalna wyściela błonę otoczki nienaczyniowej i działa jako miejsce wymiany gazowego tlenu i dwutlenku węgla między zarodkiem a środowiskiem.
Aby wygenerować model raka CAM, zacznij od żywego, zapłodnionego jaja kurzego z w pełni rozwiniętym CAM z częściowo otwartą skorupą, która odsłania jego rozgałęzione naczynia krwionośne. Upewnij się, że CAM jest odłączony od membrany powłoki.
Umieść sterylny nieprzywierający pierścień nad punktem rozgałęzienia naczynia krwionośnego. Za pomocą szklanego pręta delikatnie przetrzyj membranę wewnątrz pierścienia, aby zeskrobać jego zewnętrzną warstwę nabłonkową i odsłonić leżącą pod spodem warstwę mezodermalną przenoszącą naczynia krwione. Odpipetować schłodzoną zawiesinę komórek rakowych zmieszaną z odpowiednią macierzą zewnątrzkomórkową do pierścienia. Pierścień ogranicza dyspersję komórkową.
Pozwól, aby matryca zestaliła się, aby zabezpieczyć znajdujące się w niej komórki. Uszczelnij otwór skorupki jajka i inkubuj jajo w odpowiednich warunkach. Gęste unaczynienie w warstwie mezodermalnej dostarcza tlen i niezbędne składniki odżywcze do komórek rakowych, zapewniając w ten sposób odpowiednie mikrośrodowisko do ich wzrostu i ekspansji.
Aby przygotować zawiesinę komórek rakowych do przeszczepu, należy pobrać komórki z hodowli komórek rakowych, która jest przedmiotem zainteresowania, i osadzać komórki przez odwirowanie. Odessać supernatant i mechanicznie ponownie zawiesić komórki w pozostałym podłożu. Umieścić zawiesinę komórek na lodzie i za pomocą pipety zmierzyć objętość komórek w podłożu. Następnie ponownie zawieś komórki w stężeniu od 1 do 2 milionów komórek w 20 do 100 mikrolitrach pożywki, uzupełnionej 2,7 do 4 miligramów na mililitr macierzy zewnątrzkomórkowej i dowolnymi czynnikami wzrostu lub innymi dodatkami.
W przypadku implantacji komórek rakowych, za pomocą nieprzywierającego pierścienia, umieść do 6 jaj do zagnieżdżenia na stojaku na jajka i zwiń krawędzie przezroczystego opatrunku foliowego w kierunku otwartego okna, aby usunąć folię ze skorupek. Sprawdź, czy jaja są żywotne i zdrowe. Idealne jaja będą miały duże naczynie z mniejszymi rozgałęzionymi naczyniami pośrodku otwartego obszaru.
Za pomocą zakrzywionych kleszczyków do tęczówki umieść sterylny nieprzywierający pierścień na CAM nad naczyniem, najlepiej nad punktem rozgałęzienia. Użyj sterylnego szklanego pręta do mieszania, aby delikatnie zetrzeć CAM i odpipetować zawiesinę komórek rakowych do środka pierścienia. Gdy wszystkie komórki zostaną dostarczone, uszczelnij otwór jedną czwartą kawałka przezroczystego opatrunku foliowego o wymiarach 6 na 7 centymetrów i oznacz komórkę jajową odpowiednim oznaczeniem implantu. Następnie umieść jajo bezpiecznie w inkubatorze, tak aby otwór skorupki był skierowany do pionu.