Test wirowania agarozy: technika osadzania organoidów do analizy histologicznej

Hodowle organoidów 3D komórek nowotworowych podsumowują wiele patofizjologicznych cech nowotworów u ludzi. W ten sposób te kultury in vitro stanowią doskonały model do badań nad rakiem.

Aby przetworzyć te organoidy, zacznij od kultury wstępnie uformowanych organoidów 3D wyhodowanych w odpowiedniej macierzy błony podstawnej. Dodaj żądaną pożywkę do odzyskiwania komórek i inkubuj. Pożywka ułatwia depolimeryzację żelu matrycowego, uwalniając organoidy 3D do roztworu.

Odwirować tę mieszaninę, aby granulować organoidy. Pożywka odzysku zawierająca składniki matrycy pozostaje w supernatancie. Odrzucić supernatant. Następnie dodaj roztwór paraformaldehydu do osadu organoidowego. Substancja chemiczna dostaje się do komórek organoidów i wiąże się z aminokwasami, powodując sieciowanie białek i utrwalanie próbki. Ten etap ma kluczowe znaczenie dla wszelkich dalszych zastosowań histologicznych.

Granulować organoidy w celu oddzielenia i usunięcia supernatantu zawierającego paraformaldehyd. Dodaj ciepłą stopioną agarozę do organoidów. Za pomocą igły odczepić i rozproszyć granulowane organoidy w ciekłej agarozie. Pozwól agarozie zestalić się i osadzić organoidy. Użyj czopa agarozowego zawierającego organoidy do dalszych badań histologicznych.

Aby przetworzyć organoidy do histologii, należy usunąć istniejące pożywki ze studni, uważając, aby nie zassać kopuł błony podstawnej. Dodać równą objętość roztworu do odzyskiwania komórek i inkubować płytkę przez 60 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Po inkubacji należy usunąć kopułę membrany podstawnej za pomocą pipety i zmiażdżyć ją końcówką pipety. Zbierz zdysocjowaną kopułę i roztwór do odzyskiwania komórek do 1,5-mililitrowej probówki. Odwirować probówkę o sile 300 x g i temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 5 minut, następnie usunąć supernatant i odstawić go na bok.

Zachowaj cały supernatant do ostatniego etapu, w którym potwierdzona zostanie obecność organoidów. Dodać żądaną objętość zimnego PBS i delikatnie pipetować w górę iw dół, aby mechanicznie usunąć osad bez naruszania organoidów. Powtórzyć wirowanie i usunąć supernatant.

Utrwal granulat w dopasowanej objętości 4% PFA przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu powtórzyć etap wirowania i płukania PBS. Następnie powoli dodaj 200 mikrolitrów ciepłej 2% agarozy i natychmiast, ale delikatnie, odłącz osad komórkowy od ścianki probówki, nie naruszając go, za pomocą igły o rozmiarze 25 dołączonej do 1-mililitrowej strzykawki.

W przypadku metody wirowania agarozy bardzo ważne jest, aby odłączyć osad komórkowy od ścianki probówki zaraz po dodaniu agarozy za pomocą igły o rozmiarze 25.

Gdy agaroza całkowicie zastygnie, odłącz ją od rurki za pomocą igły o rozmiarze 25 dołączonej do 1-mililitrowej strzykawki i przenieś do nowej 1,5-mililitrowej tubki. Napełnij probówkę 70% etanolem i postępuj zgodnie z konwencjonalnym protokołem odwadniania tkanek i zatapiania parafiny.

• Spin-down - A process to separate substances of different densities by centrifugation.
• Organoid paraffin embedding - A technique to preserve biological tissues in paraffin wax.
• Cell recovery solution - A solution used to dissociate cells from a matrix for further analysis.
• Agar embedding - A method to preserve tissue samples in an agarose gel block.
• Agarose embedding protocol - A detailed procedure for encasing biological samples in agarose.

• Introduce Spin-down – A method utilized to separate different-density particles by centrifugal force (e.g., spin-down).
• Key Concepts – Overview of tissue sample preservation techniques such as paraffin and agar embedding (e.g., organoid paraffin embedding).
• Underlying Mechanisms – Description of the procedure to detach and process organoids (e.g., cell recovery solution).
• Connect to Experiment – Explanation of the importance of proper organoid and agarose handling in the experiment.

• What is the spin-down technique and how is it applied in the procedure?
• How does organoid paraffin embedding contribute to tissue preservation?
• What role does cell recovery solution play during the dissociation of organoids?

• Practical Applications – Spin-down and embedding techniques in biological and medical research (e.g., spin-down).
• Industry Impact – Areas like pathology and histology benefit from these methods (e.g., organoid paraffin embedding).
• Societal Importance – Advancement in disease diagnosis and treatment (e.g., cell recovery solution).
• Link to Scientific Advancements – Development of improved tissue preservation and analysis methods.