JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:55 min • April 30th, 2023
Hodowle organoidów 3D komórek nowotworowych podsumowują wiele patofizjologicznych cech nowotworów u ludzi. W ten sposób te kultury in vitro stanowią doskonały model do badań nad rakiem.
Aby przetworzyć te organoidy, zacznij od kultury wstępnie uformowanych organoidów 3D wyhodowanych w odpowiedniej macierzy błony podstawnej. Dodaj żądaną pożywkę do odzyskiwania komórek i inkubuj. Pożywka ułatwia depolimeryzację żelu matrycowego, uwalniając organoidy 3D do roztworu.
Odwirować tę mieszaninę, aby granulować organoidy. Pożywka odzysku zawierająca składniki matrycy pozostaje w supernatancie. Odrzucić supernatant. Następnie dodaj roztwór paraformaldehydu do osadu organoidowego. Substancja chemiczna dostaje się do komórek organoidów i wiąże się z aminokwasami, powodując sieciowanie białek i utrwalanie próbki. Ten etap ma kluczowe znaczenie dla wszelkich dalszych zastosowań histologicznych.
Granulować organoidy w celu oddzielenia i usunięcia supernatantu zawierającego paraformaldehyd. Dodaj ciepłą stopioną agarozę do organoidów. Za pomocą igły odczepić i rozproszyć granulowane organoidy w ciekłej agarozie. Pozwól agarozie zestalić się i osadzić organoidy. Użyj czopa agarozowego zawierającego organoidy do dalszych badań histologicznych.
Aby przetworzyć organoidy do histologii, należy usunąć istniejące pożywki ze studni, uważając, aby nie zassać kopuł błony podstawnej. Dodać równą objętość roztworu do odzyskiwania komórek i inkubować płytkę przez 60 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Po inkubacji należy usunąć kopułę membrany podstawnej za pomocą pipety i zmiażdżyć ją końcówką pipety. Zbierz zdysocjowaną kopułę i roztwór do odzyskiwania komórek do 1,5-mililitrowej probówki. Odwirować probówkę o sile 300 x g i temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 5 minut, następnie usunąć supernatant i odstawić go na bok.
Zachowaj cały supernatant do ostatniego etapu, w którym potwierdzona zostanie obecność organoidów. Dodać żądaną objętość zimnego PBS i delikatnie pipetować w górę iw dół, aby mechanicznie usunąć osad bez naruszania organoidów. Powtórzyć wirowanie i usunąć supernatant.
Utrwal granulat w dopasowanej objętości 4% PFA przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu powtórzyć etap wirowania i płukania PBS. Następnie powoli dodaj 200 mikrolitrów ciepłej 2% agarozy i natychmiast, ale delikatnie, odłącz osad komórkowy od ścianki probówki, nie naruszając go, za pomocą igły o rozmiarze 25 dołączonej do 1-mililitrowej strzykawki.
W przypadku metody wirowania agarozy bardzo ważne jest, aby odłączyć osad komórkowy od ścianki probówki zaraz po dodaniu agarozy za pomocą igły o rozmiarze 25.
Gdy agaroza całkowicie zastygnie, odłącz ją od rurki za pomocą igły o rozmiarze 25 dołączonej do 1-mililitrowej strzykawki i przenieś do nowej 1,5-mililitrowej tubki. Napełnij probówkę 70% etanolem i postępuj zgodnie z konwencjonalnym protokołem odwadniania tkanek i zatapiania parafiny.