Test organoidów prostaty: technika hodowli ex vivo oparta na pierścieniu żelowym Matrix w celu zbadania zdolności różnicowania komórek nabłonka prostaty

Nabłonek prostaty składa się przede wszystkim z komórek nabłonka podstawnego i nabłonka światła. Monowarstwa komórek podstawnych tworzy zewnętrzną wyściółkę gruczołu i wspomaga przeżycie komórek świetlnych. I odwrotnie, komórki światła wyściełają światło i wydzielają białka specyficzne dla prostaty.

Aby zbadać różnicowanie nabłonka gruczołu krokowego ex vivo, należy rozpocząć od zawieszenia komórek podstawnego nabłonka gruczołu krokowego. Wymieszać zawiesinę ze schłodzoną matrycą membrany podstawnej w pożądanym stosunku. Odpipetować tę mieszaninę obok podstawy wewnętrznej ścianki płytki hodowlanej odstraszającej komórki. Zakręć płytką, aby mieszanina utworzyła pierścień wzdłuż obwodu studni.

Inkubować płytkę, aby matryca zestaliła się. Uzupełnij kulturę preferowaną pożywką. Czynniki wzrostu w pożywce wspomagają proliferację komórek podstawnych nabłonka. Jednocześnie odstraszający komórki charakter naczynia hodowlanego zapobiega przyczepianiu się komórek, zachęcając je do tworzenia sferoid 3D w matrycy.

Z biegiem czasu w sferoidach rozwijają się światła otoczone wielowarstwowym nabłonkiem. Komórki nabłonka podstawy wyściełające światło ostatecznie różnicują się i tworzą wydzielnicze komórki świetlne, dając początek strukturom gruczołowym 3D.

Rozpocznij tę procedurę od przygotowania mysich komórek podstawnego i luminalnego nabłonka prostaty zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umyj osad komórkowy w 500 mikrolitrach pożywki z organoidów mysich. Następnie ponownie zawieś granulkę przy gęstości komórek 1,000 komórek na mikrolitr. Aby przygotować mieszanki wzorcowe, wymieszaj komórki nabłonkowe zawieszone w mysich pożywkach organoidowych z żelem matrycowym, aby uzyskać końcową mieszaninę, która zawiera 25% komórek w pożywce i 75% żelu macierzyowego. W zależności od dalszego zastosowania, komórki podstawowe są zwykle powlekane w stężeniu od 100 do 2,000 komórek na 80 mikrolitrów, podczas gdy komórki luminalne są siane w stężeniu od 2,000 do 10,000 komórek na 80 mikrolitrów.

Do każdej mieszaniny komórek dodać 80 mikrolitrów żelu matrycowego na dołek 24-dołkowej płytki. Odpipetuj kroplę na dolną połowę ścianki studzienki, unikając bezpośredniego kontaktu z powłoką poly-HEMA. Po dodaniu żelu matrycowego zakręć płytką, aby mieszanina komórek żelu matrycowego utworzyła pierścień wokół krawędzi studzienki. Umieść 24-dołkową płytkę w inkubatorze CO2 o temperaturze 5% stopni Celsjusza, prawą stroną do góry, na 10 minut, aby żel matrycowy częściowo stwardniał.

Po inkubacji przez 10 minut odwróć 24-dołkową płytkę do góry nogami i inkubuj przez dodatkowe 50 minut, aby żel matrycowy całkowicie stwardniał. Następnie dodaj 350 mikrolitrów wstępnie podgrzanych pożywki z organoidów mysich, kroplami, do środka każdej studzienki. Po dodaniu pożywki należy umieścić 24-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze.

Aby uzupełnić pożywkę organoidową myszy, przechyl 24-dołkową płytkę pod kątem 45 stopni i delikatnie usuń istniejące podłoże ze środka każdej studzienki za pomocą pipety P1000, unikając pierścienia żelowego matrycy. Dodaj 350 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki organoidowej dla myszy, tak jak poprzednio. Zaleca się dodawanie większej objętości pożywki do organoidów hodowanych dłużej niż pięć dni, aby zapobiec szybkiemu wyczerpaniu kluczowych składników odżywczych i czynników wzrostu.

• Prostate Epithelium - Consists of basal and luminal cells forming the prostate gland's structure.
• Basal Cells - Cells forming the outer lining of the prostate epithelium.
• Luminal Cells - Cells lining the lumen of the prostate gland and secreting prostate-specific proteins.
• 3D Spheroids - Cell structures formed in a cell-repellent environment.
• Organoid Assay - A method to study cell differentiation and formation of 3D glandular structures ex vivo.

• Introduction to Prostate Epithelium - It is formed of basal and luminal cells (e.g., prostate epithelial cells).
• Outline of Cellular Components - Basal cells support luminal cell survival; luminal cells line the lumen (e.g., organoid assay).
• Explanation of 3D Spheroids Formation - Grown within a matrix in a cell-repellent environment.
• Connection to Experiment - Formation of luminal cells from basal cells in 3D glandular structures.

• What are prostate epithelial cells and their role in the prostate epithelium?
• How does the organoid assay contribute to the study of prostatic epithelial differentiation?
• What is the process of 3D spheroids formation in a cell-repellent environment?

• Practical Applications - Used to study cell differentiation and formation of glandular structures ex vivo (e.g., organoid assay).
• Industry Impact - Crucial for biomedical research and development in urology (e.g., prostate health).
• Societal Importance - Contributes to better understanding and treatment of prostate diseases (e.g., prostate cancer).
• Scientific Advancements - Enabled the study of prostate cell proliferation and differentiation.