Ekstrakcja lizatu białkowego: technika lizy organoidów w celu zbierania białek komórkowych

Lizat komórkowy, czyli płyn zawierający lizowaną zawartość komórek, znajduje zastosowanie w dalszych procesach, takich jak ekstrakcja i analiza białek. Badanie tych frakcji ujawnia informacje o cechach i funkcjach komórek.

Aby przygotować lizaty białek organoidowych, zacznij od kultury organoidów wyhodowanych w pożądanej macierzy błony podstawnej. Usuń zużytą pożywkę hodowlaną z naczynia. Dodaj ciepłe podłoże zawierające proteazy na matrycę. Pipetować kilkakrotnie, aby usunąć matrycę z naczynia.

Inkubować mieszaninę. Enzymy proteolityczne w pożywkach degradują macierz i uwalniają organoidy do roztworu. Odwirować próbkę, aby oddzielić organoidy od supernatantu zawierającego enzym.

Zawiesić osad organoidowy w odpowiednim buforze do lizy białek. Przeprowadzić inkubację próbki. Detergenty zawarte w buforze rozrywają błony komórkowe organoidów, uwalniając zawartość wewnątrzkomórkową do roztworu. Jednocześnie inhibitory białek w buforze dezaktywują wszelkie uwolnione enzymy proteazy i fosfatazy, zapobiegając degradacji ich białek substratowych.

Następnie należy poddać mieszaninę sonikacji, aby całkowicie rozbić komórki. Otoczka jądrowa pęka i uwalnia białka jądrowe do roztworu. Fale dźwiękowe ścinają również uwalniane kwasy nukleinowe, zapobiegając ich zanieczyszczeniu lizatu białkowego.

Aby zebrać organoidy, należy kilkakrotnie przedmuchać żel matrycowy, pipetując 1 mililitr wstępnie podgrzanego podłoża zawierającego dyspazę bezpośrednio na pierścień żelowy matrycy, aż cały pierścień zostanie usunięty. Przenieś usuniętą mieszaninę organoidów żelu matrycowego do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Po całkowitym rozpaleniu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, dodać sól fizjologiczną buforowaną fosforanami do osadu organoidowego i ponownie zawiesić przez delikatne strzepnięcie.

Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant za pomocą mikropipety. Zawiesić osady organoidów w 100 mikrolitrach buforu do lizy białek na 10 mikrolitrów objętości upakowanych komórek. Przesuń, aby ponownie zawiesić. Teraz należy poddać organoidy działaniu sonikacji, zanurzając probówki w mokrym lodzie i delikatnie przykładając końcówkę dysmembratora sonicznego na zewnątrz probówki do mikrowirówki. Sonikuj przez 40 sekund przy 20 kHz przed przystąpieniem do western blot z ustalonymi protokołami.