Indukcja autofagii oparta na ADI w komórkach raka prostaty: oparta na enzymach technika pomiaru odpowiedzi autofagicznej w komórkach

Autofagia to proces wewnątrzkomórkowy, który ułatwia degradację niepożądanych składników cytoplazmatycznych i organelli w wyspecjalizowanych przedziałach trawiennych zwanych lizosomami. Aby ocenić autofagię, zacznij od przylegającej hodowli komórek raka prostaty wykazujących ekspresję autofagicznych białek markerowych zwanych LC3 sprzężonych z zielonymi białkami fluorescencyjnymi.

Z natury komórkom raka prostaty brakuje enzymu syntazy argininobursztynianu niezbędnego do syntezy aminokwasów argininy. Komórki te są zatem zależne od zewnętrznej suplementacji argininy za pomocą pożywek w celu przetrwania i proliferacji.

Następnie potraktuj komórki deiminazą argininy lub ADI. ADI hydrolizuje wolną argininę w pożywce, prowadząc do wyczerpania argininy. W konsekwencji komórki poddawane są stresowi metabolicznemu, inicjując wewnętrznie odpowiedź autofagiczną. Jednocześnie potraktuj komórki czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym, który oznacza lizosomy w komórkach.

Podczas autofagii błoniaste struktury w kształcie miseczki zwane fagoforami gromadzą się wokół uszkodzonych składników cytoplazmatycznych. W końcu rozszerzają się i uszczelniają swój ładunek, jednocześnie koniugując się z autofagicznymi białkami markerowymi LC3, tworząc pęcherzyki lub autofagosomy z podwójnymi błonami. Białka LC3 dostarczają również znaczniki fluorescencyjne do autofagosomów. Pęcherzyki następnie łączą się z lizosomami, tworząc autolizosomy. Proteazy lizosomalne w autolizosomach degradują pochłonięte składniki komórkowe.

W czasie rzeczywistym obserwuj jasną fluorescencję autofagosomów i lizosomów, aby określić ich rozmieszczenie w komórkach.

Na początek hoduj ludzkie komórki raka prostaty wykazujące ekspresję zielonego fluorescencyjnego łańcucha świetlnego sprzężonego z białkiem 3 na 35-milimetrowych naczyniach hodowlanych ze szkła pokrytego poli-D-lizyną, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Komórki powinny być posiane z wystarczającą gęstością, aby ułatwić szybką proliferację, ale nie na tyle, aby komórki były przerośnięte i zlepione do czasu obrazowania. Potraktuj wybrane próbki komórek deaminazą argininy lub ADI w PBS, aby zubożyć komórki w wolną argininę i wywołać stres metaboliczny w komórkach rakowych.

Na około godzinę przed obrazowaniem rozcieńczyć 1,5 mikrolitra LysoTracker Red z 20 mililitrami RPMI zawierającymi 10% FBS i 1% antybiotyków. Przygotuj roztwory z ADI dla wybranych próbek, które zostały poddane obróbce.

Po podgrzaniu wszystkich pożywek do 37 stopni Celsjusza dodaj odpowiednią pożywkę do każdego naczynia hodowlanego. Inkubuj komórki z RPMI zawierającym LysoTracker Red przez 15 do 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Na około 30 minut przed obrazowaniem włącz obudowę środowiskową stacji pogodowej i pozwól na zrównoważenie do 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Umyj komórki PBS i zastąp pożywkę standardowym RPMI zawierającą tylko 10% FBS i 1% antybiotyków.

Dodaj ADI do próbek zgodnie ze wskazaniami. Zamontuj 35-milimetrową pokrywę naczyń hodowlanych ze szklanym dnem w niestandardowym adapterze. Użyj olejku immersyjnego na obiektywie obiektywowym o powiększeniu 60x, aperturze numerycznej 1.42 i umieść zamontowaną miskę hodowlaną na stoliku mikroskopu.

• Autophagy - An intracellular process that degrades unwanted cytoplasmic components.
• Argininosuccinate Synthase - An enzyme absent in prostate cancer cells essential for arginine synthesis.
• Arginine Deiminase (ADI) - Enzyme that hydrolyzes free arginine in media, causing cell stress.
• LC3 Proteins - Autophagic marker proteins that provide fluorescent tags to autophagosomes.
• Lysotracker Red DND-99 - A dye used to label lysosomes within cells during autophagy.

• Introduce Autophagy - A degradative process eliminating unwanted parts in cells (e.g., autophagy video).
• Outline Prostate Cancer Cells - Lacking an enzyme, they depend on external arginine sources (e.g., prostate enzyme).
• Explain Induction of Autophagy - ADI depletes arginine causing autophagy in the cells (e.g., autophagy induction).
• Connect to Experiment - The cells are simultaneously treated with lysotracker red DND-99 (e.g., autophagy dye).

• What is autophagy and how does it relate to prostate cancer cells (include ADI)?
• What are LC3 proteins and their role in autophagy?
• How does Arginine Deiminase initiate an autophagic response in cells?

• Practical Applications - Autophagy serves as a potential target for prostate cancer treatment (e.g., autophagy and prostate cancer).
• Industry Impact - Autophagy research benefits healthcare and pharmaceutical sectors (e.g., prostate cancer enzyme marker).
• Societal Importance - Observing real-time autophagy in cells can inform disease treatments (e.g., autophagy videos).
• Link to Scientific Advancements - Dyes like lysotracker red dnd-99 help visualize cellular processes.