JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:45 min • April 30th, 2023
Autofagia to proces wewnątrzkomórkowy, który ułatwia degradację niepożądanych składników cytoplazmatycznych i organelli w wyspecjalizowanych przedziałach trawiennych zwanych lizosomami. Aby ocenić autofagię, zacznij od przylegającej hodowli komórek raka prostaty wykazujących ekspresję autofagicznych białek markerowych zwanych LC3 sprzężonych z zielonymi białkami fluorescencyjnymi.
Z natury komórkom raka prostaty brakuje enzymu syntazy argininobursztynianu niezbędnego do syntezy aminokwasów argininy. Komórki te są zatem zależne od zewnętrznej suplementacji argininy za pomocą pożywek w celu przetrwania i proliferacji.
Następnie potraktuj komórki deiminazą argininy lub ADI. ADI hydrolizuje wolną argininę w pożywce, prowadząc do wyczerpania argininy. W konsekwencji komórki poddawane są stresowi metabolicznemu, inicjując wewnętrznie odpowiedź autofagiczną. Jednocześnie potraktuj komórki czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym, który oznacza lizosomy w komórkach.
Podczas autofagii błoniaste struktury w kształcie miseczki zwane fagoforami gromadzą się wokół uszkodzonych składników cytoplazmatycznych. W końcu rozszerzają się i uszczelniają swój ładunek, jednocześnie koniugując się z autofagicznymi białkami markerowymi LC3, tworząc pęcherzyki lub autofagosomy z podwójnymi błonami. Białka LC3 dostarczają również znaczniki fluorescencyjne do autofagosomów. Pęcherzyki następnie łączą się z lizosomami, tworząc autolizosomy. Proteazy lizosomalne w autolizosomach degradują pochłonięte składniki komórkowe.
W czasie rzeczywistym obserwuj jasną fluorescencję autofagosomów i lizosomów, aby określić ich rozmieszczenie w komórkach.
Na początek hoduj ludzkie komórki raka prostaty wykazujące ekspresję zielonego fluorescencyjnego łańcucha świetlnego sprzężonego z białkiem 3 na 35-milimetrowych naczyniach hodowlanych ze szkła pokrytego poli-D-lizyną, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Komórki powinny być posiane z wystarczającą gęstością, aby ułatwić szybką proliferację, ale nie na tyle, aby komórki były przerośnięte i zlepione do czasu obrazowania. Potraktuj wybrane próbki komórek deaminazą argininy lub ADI w PBS, aby zubożyć komórki w wolną argininę i wywołać stres metaboliczny w komórkach rakowych.
Na około godzinę przed obrazowaniem rozcieńczyć 1,5 mikrolitra LysoTracker Red z 20 mililitrami RPMI zawierającymi 10% FBS i 1% antybiotyków. Przygotuj roztwory z ADI dla wybranych próbek, które zostały poddane obróbce.
Po podgrzaniu wszystkich pożywek do 37 stopni Celsjusza dodaj odpowiednią pożywkę do każdego naczynia hodowlanego. Inkubuj komórki z RPMI zawierającym LysoTracker Red przez 15 do 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Na około 30 minut przed obrazowaniem włącz obudowę środowiskową stacji pogodowej i pozwól na zrównoważenie do 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Umyj komórki PBS i zastąp pożywkę standardowym RPMI zawierającą tylko 10% FBS i 1% antybiotyków.
Dodaj ADI do próbek zgodnie ze wskazaniami. Zamontuj 35-milimetrową pokrywę naczyń hodowlanych ze szklanym dnem w niestandardowym adapterze. Użyj olejku immersyjnego na obiektywie obiektywowym o powiększeniu 60x, aperturze numerycznej 1.42 i umieść zamontowaną miskę hodowlaną na stoliku mikroskopu.