Ekstrakcja białek i proteoliza: metoda pozyskiwania białek z próbek tkanki guza prostaty i ich enzymatycznego trawienia do peptydów

Zacznij od próbki tkanki guza prostaty. Zawieś go ponownie w schłodzonym buforze do lizy, aby zainicjować lizę komórek. Użyj homogenizatora, aby dalej rozbić struktury tkankowe i uwolnić ich składniki wewnątrzkomórkowe. Sonikować próbkę na lodzie, aby zapewnić całkowitą lizę komórek i ścinać DNA, aby zapobiec zakłóceniom podczas przetwarzania peptydów. Podgrzej lizat, aby zakłócić trzeciorzędową strukturę białek i rozwinąć się.

Środki redukujące w buforze rozszczepiają wiązania dwusiarczkowe między resztą cysteiny. Następnie środki alkilujące w buforze alkilują wolne grupy tiolowe zredukowanych cystein, aby zapobiec tworzeniu się wiązań dwusiarczkowych. Dodatkowe czynniki denaturujące w buforze ułatwiają kontrolowaną denaturację i dalsze rozwijanie białek.

Wirówka do granulowania resztek tkanek i wszelkich zanieczyszczeń. Zebrać supernatant zawierający mieszaninę białek do świeżej probówki. Dodaj enzym endopeptydazę lizylową, aby rozszczepić wiązania peptydowe w białkach na końcu C reszt lizyny, tworząc duże peptydy. Ponadto potraktuj enzymem trypsyną, aby rozszczepić wiązania peptydowe na końcu C reszt lizyny i argininy i wytworzyć mniejsze peptydy. Przenieść mieszaninę do odśrodk