JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:21 min. • April 30th, 2023
Aby wyizolować i oczyścić peptydy, należy rozpocząć od zawiesiny lizatu białkowego zawierającej mieszaninę strawionych peptydów.
Mieszaninę należy potraktować kwasem trifluorooctowym lub odczynnikiem na bazie TFA. Ten anionowy lub ujemnie naładowany odczynnik tworzy kompleks par jonowych z zasadowymi lub dodatnio naładowanymi resztami na peptydach, maskując w ten sposób ich ładunek i poprawiając hydrofobowość peptydów.
Teraz zmontuj wysokosprawną chromatografię cieczową z odwróconymi fazami lub RP-HPLC, kolumnę zawierającą porowatą fazę stacjonarną na bazie krzemionki, unieruchomioną niepolarnymi ligandami hydrofobowymi. Dodaj kompatybilny z peptydami bufor równowagowy do kolumny, aby przygotować fazę stacjonarną przed nałożeniem próbki.
Teraz załaduj zakwaszoną próbkę do kolumny. W kolumnie peptydy hydrofobowe selektywnie adsorbują się do hydrofobowych ligandów fazy stacjonarnej. Uruchom bufor myjący przez kolumnę, aby usunąć wszelkie niezwiązane lub niepożądane cząstki.
Następnie przepuść przez kolumnę mniej polarny bufor elucji organicznej o wysokiej hydrofobowości. Ze względu na ich selektywne powinowactwo do buforu elucyjnego, związane peptydy ulegają desorpcji z matrycy kolumny.
Zebrać eluat zawierający peptyd z kolumny. Liofilizuj eluat w celu usunięcia zawartości wody i uzyskania suchego proszku czystych i stabilnych peptydów.
Aby zakwasić próbkę, dodaj około 20 mikrolitrów 5% kwasu trifluorooctowego lub TFA na mililitr lizatu. Dobrze wymieszaj probówkę i użyj paska pH do zmierzenia pH. W razie potrzeby dodaj dodatkowe 5% TFA, aby dostosować pH do 2,5. Następnie podłącz krótszy koniec kolumny C18 do kolektora próżniowego. Po ustawieniu próżni w zakresie od 17 do 34 kPa należy użyć 3 mililitrów 100% acetonitrylu i szklanej pipety do zwilżenia kolumny.
Zrównoważyć kolumnę za pomocą szklanej pipety i nałożyć dwie 3-mililitrowe podwielokrotności 0,1% TFA. Następnie załadować zakwaszoną próbkę do kolumny. Użyj trzech 3-mililitrowych objętości 0,1% TFA do umycia kolumny. Następnie nałóż 2 mililitry 40% ACN, 0,1% TFA, aby wymyć próbkę i zebrać dwie 2-mililitrowe frakcje do szklanych probówek hodowlanych. Za pomocą parafilmu przykryj probówki eluacyjne i użyj igły o rozmiarze 20, aby przebić od trzech do pięciu otworów w pokrywie przed liofilizacją próbek przez noc.