Oczyszczanie peptydów: technika ekstrakcji peptydów z trawionych lizatów białkowych oparta na RP-HPLC

Aby wyizolować i oczyścić peptydy, należy rozpocząć od zawiesiny lizatu białkowego zawierającej mieszaninę strawionych peptydów.

Mieszaninę należy potraktować kwasem trifluorooctowym lub odczynnikiem na bazie TFA. Ten anionowy lub ujemnie naładowany odczynnik tworzy kompleks par jonowych z zasadowymi lub dodatnio naładowanymi resztami na peptydach, maskując w ten sposób ich ładunek i poprawiając hydrofobowość peptydów.

Teraz zmontuj wysokosprawną chromatografię cieczową z odwróconymi fazami lub RP-HPLC, kolumnę zawierającą porowatą fazę stacjonarną na bazie krzemionki, unieruchomioną niepolarnymi ligandami hydrofobowymi. Dodaj kompatybilny z peptydami bufor równowagowy do kolumny, aby przygotować fazę stacjonarną przed nałożeniem próbki.

Teraz załaduj zakwaszoną próbkę do kolumny. W kolumnie peptydy hydrofobowe selektywnie adsorbują się do hydrofobowych ligandów fazy stacjonarnej. Uruchom bufor myjący przez kolumnę, aby usunąć wszelkie niezwiązane lub niepożądane cząstki.

Następnie przepuść przez kolumnę mniej polarny bufor elucji organicznej o wysokiej hydrofobowości. Ze względu na ich selektywne powinowactwo do buforu elucyjnego, związane peptydy ulegają desorpcji z matrycy kolum