JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 4:50 min. • April 30th, 2023
Fosforylacja określonych reszt aminokwasowych, takich jak tyrozyna, generuje fosfopeptydy, które odgrywają kluczową rolę w regulacji kilku komórkowych szlaków sygnałowych. Ich badanie pozwala na identyfikację potencjalnych biomarkerów dla terapii nowotworów.
Aby wyizolować fosfopeptydy, zacznij od liofilizowanego proszku oczyszczonych peptydów trawionych z tkanki rakowej. Zawiesić proszek w odpowiednim buforze, aby przygotować jednolitą zawiesinę peptydową. Utrzymuj neutralne pH, aby zapewnić stabilność peptydów.
Przygotować zawiesinę składającą się z kulek hydrożelowych sprzężonych ze specyficznymi przeciwciałami antyfosfopeptydowymi w żądanym buforze. Dodaj zawiesinę perełek do zawiesiny peptydowej. Przeciwciała unieruchomione na kulkach rozpoznają i wiążą się ze swoimi specyficznymi fosforylowanymi resztami aminokwasowymi w fosfopeptydach, tworząc kompleksy.
Odwirować mieszaninę, aby zebrać kompleksy fosfopeptyd-kulki w osadzie. Usunąć supernatant zawierający niezwiązane peptydy lub niespecyficzne fosfopeptydy. Dodać odpowiedni bufor elucyjny o niskim pH do kompleksów i inkubować. Niskie pH osłabia oddziaływanie między resztami fosfopeptydu a kompleksami przeciwciało-kulki, uwal
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych