JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 4:50 min • April 30th, 2023
Fosforylacja określonych reszt aminokwasowych, takich jak tyrozyna, generuje fosfopeptydy, które odgrywają kluczową rolę w regulacji kilku komórkowych szlaków sygnałowych. Ich badanie pozwala na identyfikację potencjalnych biomarkerów dla terapii nowotworów.
Aby wyizolować fosfopeptydy, zacznij od liofilizowanego proszku oczyszczonych peptydów trawionych z tkanki rakowej. Zawiesić proszek w odpowiednim buforze, aby przygotować jednolitą zawiesinę peptydową. Utrzymuj neutralne pH, aby zapewnić stabilność peptydów.
Przygotować zawiesinę składającą się z kulek hydrożelowych sprzężonych ze specyficznymi przeciwciałami antyfosfopeptydowymi w żądanym buforze. Dodaj zawiesinę perełek do zawiesiny peptydowej. Przeciwciała unieruchomione na kulkach rozpoznają i wiążą się ze swoimi specyficznymi fosforylowanymi resztami aminokwasowymi w fosfopeptydach, tworząc kompleksy.
Odwirować mieszaninę, aby zebrać kompleksy fosfopeptyd-kulki w osadzie. Usunąć supernatant zawierający niezwiązane peptydy lub niespecyficzne fosfopeptydy. Dodać odpowiedni bufor elucyjny o niskim pH do kompleksów i inkubować. Niskie pH osłabia oddziaływanie między resztami fosfopeptydu a kompleksami przeciwciało-kulki, uwalniając peptydy do roztworu.
Przenieś mieszaninę do wstępnie zmontowanego wkładu filtrującego. Odwirować w celu wymycia uwolnionych fosfopeptydów do probówki zbiorczej. Zagęścić próżniowo próbkę w podwyższonej temperaturze w celu usunięcia buforu i otrzymania zagęszczonej suchej osadki czystych fosfopeptydów.
Ponownie zawiesić liofilizowany proszek z 0,5 mililitra lodowatego buforu immunoprecypitacyjnego lub IP, wiążącego w każdej frakcji. Przenieś 0,5 mililitra objętości do zawiesiny z drugiej frakcji do probówki z pierwszą frakcją i zachowaj końcówkę pipety. Użyj kolejnych 0,5 mililitra buforu IP, aby przepłukać każdą probówkę liofilizacji przed przeniesieniem zawartości do krioprobówki. Następnie powtórz płukanie przy użyciu 2 mililitrów buforu IP.
Po użyciu P200 z odciętą końcówką do przeniesienia 0,5 miligrama na mililitr bulionu zawiesiny kulek przeciwciała do probówki z mikrofugami, dodaj 450 mikrolitrów lodowatego buforu wiążącego IP, aby przepłukać 50 mikrolitrów zawiesiny kulki przeciwciała 4G10 i 25 mikrolitrów zawiesiny kulek przeciwciała 27B10.4 w probówce do mikrofuge. Odwirować probówkę o masie 100 x g i 4 stopnie Celsjusza przez 1 minutę. Po zaessaniu supernatantu dodać taką samą objętość, jak oryginalna zawiesina bufora wiążącego IP, aby ponownie zawiesić kulki. Dodaj wstępnie umyte kulki pY do zawieszonego roztworu próbki w krioprobówkach z nakrętką śrubową. Następnie inkubuj je w temperaturze 4 stopni Celsjusza na rotatorze od końca do końca przez noc. Po odwirowaniu kulek zachowaj supernatant, który zostanie użyty do wzbogacenia peptydów pST.
Następnie użyj 300 mikrolitrów bufora wiążącego IP, aby ponownie zawiesić kulki i przenieść je do 2-mililitrowej probówki wirówkowej. Wirować próbki w temperaturze 100 x g i 4 stopnie Celsjusza przez 1 minutę. Następnie, za pomocą 500 mikrolitrów bufora wiążącego IP, umyj koraliki trzykrotnie. Umyj koraliki czterokrotnie 450 mikrolitrami 25 mM wodorowęglanu amonu o pH 7,5. Zanurz końcówkę z żelem nieco poniżej powierzchni stopki i całkowicie zassaj supernatant. Dodaj do koralików czterokrotność objętości ściegu wynoszącą 0,1% TFA.
Następnie dobrze je wymieszaj i inkubuj probówkę w termomikserze z prędkością 1 000 obr./min i 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Przenieść zawiesinę do filtra wirowego o średnicy 0,2 mikrometra i odwirować filtr przy stężeniu 850 x g przez 1 minutę. Po przeniesieniu elucji do probówki mikrowirówki o niskiej wiązalności białek, należy zagęścić eluat próżniowo do sucha w temperaturze 40 stopni Celsjusza z czasem ogrzewania wynoszącym 300 minut przez noc.