JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 2:31 min. • April 30th, 2023
Aby rozpocząć makrodysekcję, weź szklane szkiełko z próbką tkanki. Dodatkowo weź szkiełko referencyjne zawierające tę samą próbkę tkanki i wybarwij ją za pomocą hematoksyliny i eozyny do barwienia H&E.
W normalnych komórkach hematoksylina nadaje kwasom nukleinowym niebieskie zabarwienie, podczas gdy przeciwbarwienie eozyny sprawia, że białka komórkowe są różowe. Ciemnoniebieskie zabarwienie jądra pomaga w odróżnianiu komórek rakowych od normalnych komórek.
Nałóż szkiełko barwione H&E na szkiełko niebarwione, aby wyrównać próbki tkanek. Zlokalizuj część zawierającą komórki nowotworowe na szkiełku barwionym H&E. Zaznacz odpowiedni obszar na niezabarwionym szkiełku.
Zeskrob żądaną tkankę z niezabarwionego szkiełka. Za pomocą mokrej końcówki pipety zbierz zeskrobaną tkankę, aby zapewnić łatwe przeniesienie próbki tkanki. Przenieść tkankę do probówki zawierającej bufor do lizy. Składniki buforu do lizy trawią tkankę, uwalniając składniki komórki.
Potraktuj lizat odpowiednią proteazą i inkubuj w wysokiej temperaturze. Proteaza rozszczepia zanieczyszczające DNazy, chroniąc w ten sposób DNA przed degradacją. Przechowywać DNA zawierające lizat tkankowy do dalszej analizy.
Zidentyfikuj tkanki rakowe w obszarze guza najbardziej odpowiednie do makrodysekcji zgodnie z odpowiednim wycinkiem barwionym H&E. Następnie należy przeprowadzić makrosekcję tkanki nowotworowej na podstawie zaznaczonego fragmentu. Weź czystą żyletkę i delikatnie zeskrob tkankę rakową ze szkiełka, starając się utrzymać ją w jednym kawałku. Za pomocą końcówki pipety przenieś zeskrobaną tkankę do fiolki z buforem do lizy.
Powtórz ten proces z pozostałymi slajdami. Po tym, jak cała tkanka znajdzie się w probówce, użyj końcówki, aby upewnić się, że tkanka jest całkowicie zanurzona i nie przykleja się do ściany. Dodać 20 mikrolitrów proteazy serynowej związanej z subtylizyną do fiolki i delikatnie strzepnąć, aby wymieszać. Umieść fiolkę w bloku grzewczym o temperaturze 55 stopni Celsjusza na co najmniej 4 godziny lub na noc, upewniając się, że po 2 godzinach lekko zawirowano.