Konwersja wodorosiarczynu genomowego DNA: metoda badania metylacji DNA w próbkach genomowego DNA z tkanki raka przewodu pokarmowego

Metylacja DNA polega na dodawaniu grup metylowych do reszt cytozyny DNA w celu wytworzenia metylo-cytozyny, powodując zmianę DNA i regulację ekspresji genów.

Aby zbadać metylację DNA, zacznij od pobrania surowego ekstraktu DNA z komórek rakowych. Dodać bufor rozcieńczający i inkubować w temperaturze pokojowej. Bufor rozcieńcza mieszaninę i denaturuje dwuniciowe DNA na jednoniciowe DNA, sprzyjając dostępności zasad do kolejnych reakcji.

Dodaj odczynnik konwersyjny i inkubuj w ciemności. Wodorosiarczyn sodu w odczynniku wyzwala sulfonowanie, a następnie deaminację niemetylowanych reszt cytozyny, w wyniku czego powstaje sulfonian uracylu. Jednak metylowane reszty cytozyny pozostają niezmienione.

Następnie uzupełnij DNA buforem wiążącym i przenieś go do wstępnie zmontowanej kolumny filtra spinowego. Bufor pomaga DNA związać się z filtrem.

Odwirować w celu usunięcia mieszaniny buforu i odczynnika wodorosiarczynowego z uwięzionego DNA w kolumnie. Odrzuć przepływ. Dodaj alkaliczny bufor odsulfonacyjny do DNA. Bufor pomaga w usuwaniu grup siarczynowych z sulfonianu uracylu do wytworzenia uracylu.

Odwirować w celu usunięcia zużytego buforu. Teraz dodaj bufor elucyjny do kolumny, aby wymyć przekształcone DNA. Wykonaj PCR, aby amplifikować DNA. Wszystkie przekształcone reszty uracylu amplifikują się jako tyminy, podczas gdy metylowane reszty cytozyny amplifikują się jako cytozyny.

Sekwencjonowanie reszt cytozyny amplifikowanego DNA w celu wygenerowania profilu metylacji próbki.

Zabieg wodorosiarczynowy należy wykonać na 45 mikrolitrach strawionej tkanki za pomocą zestawu do konwersji wodorosiarczynu zgodnie z instrukcjami producenta. Dodać 5 mikrolitrów buforu rozcieńczającego do próbki i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. W międzyczasie przygotuj odczynnik konwersyjny wodorosiarczynu, dodając 750 mikrolitrów wody destylowanej i 210 mikrolitrów buforu rozcieńczającego do jednej probówki odczynnika konwersyjnego CT. Wymieszaj probówki, wirując przez 10 minut. Następnie dodaj 100 mikrolitrów przygotowanego odczynnika konwersji CT do każdej próbki i wymieszaj przez inwersję.

Próbki inkubować w ciemności w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 12 do 16 godzin. Po inkubacji umieścić próbki na lodzie na 10 minut. Dodać 400 mikrolitrów buforu wiążącego i wymieszać każdą próbkę, pipetując w górę iw dół. Załaduj każdą próbkę do kolumny wirującej i umieść kolumnę w 2-mililitrowej probówce zbiorczej. Odwirować próbki z pełną prędkością przez 1 minutę i odrzucić przepływ. Dodaj 200 mikrolitrów buforu do płukania do każdej kolumny i wiruj z pełną prędkością przez 1 minutę, a następnie wyrzuć przepływ.

Dodaj 200 mikrolitrów buforu odsiarczającego do każdej kolumny i pozostaw kolumny w temperaturze pokojowej na 15 minut. Po inkubacji obracać kolumny z pełną prędkością przez 1 minutę i odrzucić przepływ. Przemyć kolumnę dwukrotnie 200 mikrolitrami buforu do płukania, odwirowując przez 1 minutę z pełną prędkością po każdym płukaniu.

Dodaj 46 mikrolitrów wody destylowanej do każdej kolumny i umieść ją w nowej sterylnej 1,5-mililitrowej jednorazowej probówce polipropylenowej. Obracaj probówki przez 2 minuty, aby wymyć DNA i wyrzuć kolumnę. DNA jest teraz gotowe do analizy. Użyj zmodyfikowanego DNA wodorosiarczynu jako matrycy do ilościowego PCR specyficznego dla metylacji w celu oceny metylacji regionu promotora w każdej analizie genu. Połącz odczynniki zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym i użyj 96-dołkowego instrumentu do PCR w czasie rzeczywistym, aby uruchomić protokół cykli termicznych.