Izolacja neutrofili o niskiej gęstości otrzewnej: technika uzyskiwania neutrofili o niskiej gęstości z płynu do płukania otrzewnej przy użyciu magnetycznego sortowania komórek aktywowanych

Neutrofile o niskiej gęstości lub LDN to odrębna subpopulacja neutrofili występująca w podwyższonej liczbie podczas stanów patologicznych, takich jak rak przewodu pokarmowego. LDN można izolować z płukanek jamy otrzewnej lub płynu z płukania pacjentów.

Najpierw przefiltruj płyn do płukania, aby usunąć resztki tkanek. Odwirować filtrat w celu uzyskania osadu zawierającego komórki krwi, w tym LDN. Zawiesić go ponownie w odpowiednim buforze. Nałożyć tę zawiesinę na podłoże o odpowiednim gradiencie gęstości, optymalnym do izolacji LDN.

Odwirować w celu oddzielenia różnych składników krwi na podstawie ich względnej gęstości. Gęstsze erytrocyty tworzą dolną warstwę, podczas gdy najmniej gęsta frakcja plazmy tworzy najwyższą warstwę. Mniej gęste LDN zajmują warstwę pośrednią wraz z innymi komórkami jednojądrzastymi.

Przenieść warstwę pośrednią do świeżej probówki zawierającej odczynnik blokujący. Składniki odczynnika blokują niespecyficzne miejsca wiązania na wszystkich powierzchniach komórek niedocelowych i zwiększają swoistość dla LDN podczas późniejszego znakowania.

Dodaj mikrogranulki sprzężone z przeciwciałami skierowane do określonej cząsteczki powierzchniowej komórki z nadekspresją na LDN. Inkubuj, aby kompleksy przeciwciało-kulki związały się z cząsteczkami docelowymi na LDN.

Przepuścić inkubowaną zawiesinę przez kolumnę umieszczoną w polu magnetycznym. Pod wpływem magnetycznym wszystkie kompleksy mikrokulek LDN przylegają do ścianki kolumny, podczas gdy nieznakowane komórki przechodzą przez nią.

Usuń kolumnę. Przepłukać zawartość za pomocą odpowiedniego buforu w celu elucji i zebrania frakcji zawierającej LDN.

Aby uzyskać neutrofile, najpierw wstrzyknij 1 litr normalnej sterylnej soli fizjologicznej bezpośrednio przed zamknięciem rany bezpośrednio do jamy brzusznej pacjenta, który właśnie przeszedł operację jamy brzusznej z powodu nowotworu złośliwego przewodu pokarmowego, a następnie intensywnie płukaj jamę brzuszną przez co najmniej 1 minutę. Następnie wymieszaj sól fizjologiczną w jamie i odzyskaj 200 mililitrów płynu do płukania za pomocą czterech 50-mililitrowych strzykawek.

W laboratorium przenieś płyn z płukania otrzewnowej przez 100-mikrometrowy filtr nylonowy do pojedynczych 50-mililitrowych probówek w celu odwirowania. Ponownie zawiesić granulki w 5 mililitrach PBS uzupełnionych 0,02% EDTA i ostrożnie nałożyć zawiesinę każdej komórki na 3 mililitry roztworu gradientu gęstości. Po oddzieleniu gradientu gęstości zbierz od 2 do 3 mililitrów warstwy pośredniej z każdej probówki i umyj próbki płynu otrzewnowego w 10 mililitrach świeżego PBS plus EDTA na probówkę. Wlej granulki do 10 mililitrów świeżego PBS plus EDTA w celu dodatkowego przepłukania i rozcieńcz komórki do 1 razy 10 do siódmych komórek na 60 mikrometrów magnetycznego sortowania komórek aktywowanych lub MACS, stężenia buforowego.

Zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania za pomocą 20 mikrolitrów bloku Fc przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, a następnie dodaj 20 mikrolitrów kulek magnetycznych anty-CD66b. Po 10 minutach w temperaturze 4 stopni Celsjusza umyj i ponownie zawieś ogniwa w 500 mikrolitrach buforu MACS i dodaj komórki do kolumny magnetycznej o odpowiedniej wielkości w polu magnetycznym odpowiedniego separatora magnetycznego. Gdy wszystkie ujemne komórki CD66b przejdą przez kolumnę, dodaj 15 mililitrów świeżego buforu MACS do zbiornika kolumny i przenieś kolumnę z separatora magnetycznego do nowej stożkowej rurki. Następnie natychmiast zanurz kolumnę, aby przepłukać magnetycznie oznaczony dodatni CD66b do rury.

• Low-density neutrophils (LDNs) - A distinct neutrophil subpopulation increased in pathological conditions.
• Ficoll-Paque Plus protocol - Method for isolating neutrophils using density gradient separation.
• Peritoneal lavage procedure - Technique for washing and collecting fluid from the peritoneal cavity.
• Magnetic cell sorting (Miltenyi Biotec) - Technique to selectively isolate specific cells using magnetic microbeads.
• CD66b - A surface molecule overexpressed on LDNs, useful for their identification and isolation.

• Intrduce LDNs – Subtype of neutrophil prevalent in diseases like cancer (e.g., low density neutrophils).
• Outline Ficoll-Paque Plus protocol – Method for cell separation based on density (e.g., Ficoll-Paque Plus protocol).
• Explain Peritoneal lavage procedure – Technique to collect cells from the peritoneal cavity (e.g., peritoneal lavage procedure).
• Connect to Magnetic cell Sorting – Isolation of LDNs using magnetic microbeads and specific markers (e.g., CD66b).

• What are low-density neutrophils and how to identify them using peritoneal lavage procedure?
• How does Ficoll-Paque Plus protocol help in separating LDNs?
• How does magnetic cell sorting with CD66b microbeads isolate LDNs?

• Practical Applications – Isolation of LDNs for clinical and research purposes (e.g., Ficoll-Paque Plus protocol).
• Industry Impact – Advances in cell isolation techniques benefitting biomedical sector (e.g., magnetic cell sorting).
• Societal Importance – Improved understanding and treatment of certain diseases (e.g., cancer).
• Link to Scientific Advancements – Automatic isolation of specific cells aiding in research studies.