JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:05 min • April 30th, 2023
Podczas stanów patologicznych, takich jak rak, aktywowane neutrofile uwalniają zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofili lub NET - sieć zewnątrzkomórkowych włókien DNA związanych z histonami i enzymami proteolitycznymi. Struktury te zatrzymują komórki nowotworowe i odgrywają kluczową rolę w przerzutach raka.
Aby zbadać zachowanie po adhezji uwięzionych komórek nowotworowych w NET in vitro, najpierw pohoduj neutrofile o niskiej gęstości - subpopulację neutrofili - w naczyniu hodowlanym pokrytym polimerem, które ułatwia przyłączanie komórek. Inkubuj, aby aktywować neutrofile w celu uwolnienia siatkowych sieci NET.
Następnie dodaj nieprzepuszczalny dla błony zielony fluorescencyjny barwnik jądrowy, aby zabarwić włókna DNA w NET. Usuń zużyte medium. Dodaj zawiesinę komórek rakowych do kultury neutrofili
.Inkubuj kulturę przez krótki czas, aby ułatwić interakcję komórka rakowa-NET. Składnik DNA NET działa jako czynnik chemotaktyczny, który stymuluje migrację komórek rakowych i pomaga w ich adhezji do NET.
Usuń zużyte medium. Delikatnie spłucz kulturę odpowiednią świeżą pożywką, aby usunąć wszelkie niezwiązane komórki rakowe z naczynia hodowlanego. Uzupełnij świeżą pożywką zawierającą serum.
Zobrazuj hodowlę przez dłuższy czas za pomocą mikroskopii filmów poklatkowych, aby przeanalizować interaktywne zdarzenia między NET a komórkami rakowymi. Z biegiem czasu sieci NET zapewniają odpowiednie mikrośrodowisko ułatwiające namnażanie się komórek nowotworowych. Użyj odpowiedniego oprogramowania, aby obserwować proliferację komórek rakowych w zielonych sieciach fluorescencyjnych.
Posiew i wybarwienie neutrofili o niskiej gęstości otrzewnowej w 35-milimetrowym naczyniu pokrytym poli-L-lizyną, jak pokazano, a następnie krótkie mycie w 2 mililitrach 0,1% BSA plus RPMI 1640.
Zastąp pożywkę 1 razy 10 do szóstych niebarwionych komórek nowotworowych żołądka zawieszonych w 2 mililitrach RPMI uzupełnionych BSA na 5-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji przepłucz komórki w 2 mililitrach świeżego RPMI uzupełnionego BSA przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie delikatnie wiruj, aby usunąć wszelkie nieprzyłączone komórki nowotworowe.
Następnie zastąp supernatant DMEM uzupełnionym FBS i antybiotykami i zamontuj szalkę w systemie obserwacji komórek z pełnym widokiem w celu analizy poklatkowej pułapki komórek nowotworowych przez NET.