Przygotowanie bloku egzosomu: protokół ochrony egzosomów z hodowanych ludzkich komórek raka jelita grubego
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:43 min. • April 30th, 2023
Egzosomy to zewnątrzkomórkowe struktury pęcherzykowe, które są wydzielane przez hodowane komórki do supernatantu. Aby przygotować blok egzosomu, zacznij od pobrania supernatantu zawierającego egzosomy w probówce. Odwiruj probówkę z dużą prędkością, aby granulować nienaruszone egzosomy. Odrzucić pozostały supernatant.
Potraktuj osad egzosomu aldehydem glutarowym obecnym w buforze utrwalającym. Inkubuj mieszaninę na lodzie przez pożądany czas, aby zachować morfologię egzosomów. Aldehyd glutarowy infiltruje egzosomy i sieciuje białka. Bufor utrwalający utrzymuje egzosomy w neutralnym pH dla dalszego procesu utrwalania.
Wyrzuć bufor zawierający aldehyd glutarowy i dodaj roztwór tetratlenku osmu - wtórny utrwalacz, który przenika przez dwuwarstwę błony i wiąże lipidy obecne w egzosomach. Usuń roztwór tetratlenku osmu i potraktuj egzosomy serią rosnących stężeń acetonu. Proces ten odwadnia egzosomy.
Zastąp aceton bezwzględny mieszaniną średnio acetonu. Stopniowo zwiększaj stosunek podłoża do zatapiania w tej mieszaninie.
Wlej mieszaninę do osadzania zawierającą egzosomy do pożądanych foremek. Wysuszyć formy w piekarniku w wysokiej temperaturze. Doprowadzi to do polimeryzacji pożywki osad
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych