JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:43 min. • April 30th, 2023
Egzosomy to zewnątrzkomórkowe struktury pęcherzykowe, które są wydzielane przez hodowane komórki do supernatantu. Aby przygotować blok egzosomu, zacznij od pobrania supernatantu zawierającego egzosomy w probówce. Odwiruj probówkę z dużą prędkością, aby granulować nienaruszone egzosomy. Odrzucić pozostały supernatant.
Potraktuj osad egzosomu aldehydem glutarowym obecnym w buforze utrwalającym. Inkubuj mieszaninę na lodzie przez pożądany czas, aby zachować morfologię egzosomów. Aldehyd glutarowy infiltruje egzosomy i sieciuje białka. Bufor utrwalający utrzymuje egzosomy w neutralnym pH dla dalszego procesu utrwalania.
Wyrzuć bufor zawierający aldehyd glutarowy i dodaj roztwór tetratlenku osmu - wtórny utrwalacz, który przenika przez dwuwarstwę błony i wiąże lipidy obecne w egzosomach. Usuń roztwór tetratlenku osmu i potraktuj egzosomy serią rosnących stężeń acetonu. Proces ten odwadnia egzosomy.
Zastąp aceton bezwzględny mieszaniną średnio acetonu. Stopniowo zwiększaj stosunek podłoża do zatapiania w tej mieszaninie.
Wlej mieszaninę do osadzania zawierającą egzosomy do pożądanych foremek. Wysuszyć formy w piekarniku w wysokiej temperaturze. Doprowadzi to do polimeryzacji pożywki osadzającej wokół egzosomów, powodując powstanie bloków.
Aby utrwalić oczyszczony osad egzosomu, dodaj 1 mililitr 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M roztworze kakodylanu sodu o pH 7,0. Inkubować pęcherzyki dwuwarstwowe lipidów przez 1 godzinę w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie usuń utrwalacz i przepłucz granulki 1 mililitrem 0,1 M roztworu buforowego kakodylanu sodu w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
Następnie utrwal próbki 1 mililitrem 2% tetratlenku osmu przez 1 godzinę w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Usunąć utrwalacz i przepłukać osad egzosomu trzykrotnie 0,1 M buforem kakodylanu sodu, zmieniając bufor co 10 minut. Następnie odwodnić próbkę, potrząsając nią przez 10 minut w serii stopniowanych stężeń acetonu.
Następnie wymieszaj roztwór składający się z trzech części acetonu i jednej części mieszanki do zatapiania o niskiej lepkości. Zastąp aceton tą mieszaniną i inkubuj próbkę przez 30 minut. Kontynuuj zwiększanie stosunku podłoża do zatapiania o niskiej lepkości, inkubując przez 30 minut z każdym krokiem.
Na koniec inkubuj osad egzosomu w 100% mieszaninie do osadzania o niskiej lepkości przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia zanurz próbkę w czystej mieszance do zatapiania o niskiej lepkości za pomocą formy do zatapiania i piecz przez 24 godziny w temperaturze 65 stopni Celsjusza.