JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 2:32 min. • April 30th, 2023
Egzosomy to naniszone, kuliste pęcherzyki otoczone dwuwarstwą lipidową zawierającą cząsteczki DNA, RNA i białka obecne wewnątrz światła.
Aby zobrazować strukturę egzosomu za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej lub TEM, zacznij od pobrania bloku egzosomu - stałego bloku matrycy zawierającego osadzone egzosomy. Za pomocą ultramikrotomu uzyskaj ultracienkie odcinki bloku egzosomu.
Zbierz sekcję egzosomu na odpowiedniej siatce i pozwól jej przylegać do powierzchni. Siatka zapewnia stabilne podparcie próbki egzosomu podczas kolejnych etapów barwienia.
Następnie umieść siatkę nad kroplą octanu uranylu - plamy z metalu ciężkiego - i inkubuj przez żądany czas. Jony uranylowe oddziałują z lipidami, białkami, DNA i RNA obecnymi w egzosomach.
Następnie wybarwić sekcję egzosomu cytrynianem ołowiu, który również wiąże się z egzosomalnymi biomolekułami. Cytrynian ołowiu słabo wiąże się z wstępnie związanymi jonami uranylu i zwiększa kontrast z tłem podczas obrazowania.
Obserwuj podwójnie wybarwione egzosomy za pomocą TEM. TEM skupia wiązkę elektronów na próbce egzosomu. Barwione obszary w egzosomie rozpraszają elektrony silniej w porównaniu z obszarami niebarwionymi.
Apertura obiektywu filtruje te silnie rozproszone elektrony. W ten sposób egzosomy zawierające barwione biomolekuły wydają się ciemniejsze niż tło.
Za pomocą ultramikrotomu przygotuj skrawki o grubości 60 nanometrów. Umieść skrawki na siatce niklowej i dwukrotnie zabarwij niektóre z nich 2% octanem uranylu przez 20 minut, a następnie cytrynianem ołowiu przez 10 minut. Następnie umieść wybarwiony fragment w transmisyjnym mikroskopie elektronowym i obejrzyj próbkę przy napięciu 80 kV i postępuj zgodnie z automatycznymi ustawieniami czasu ekspozycji. Mając w zasięgu wzroku obraz egzosomu, uzyskaj i zapisz obraz za pomocą oprogramowania mikroskopu.