JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:10 min. • April 30th, 2023
Aby wykonać barwienie ujemne egzosomów - nanosferycznych, kulistych pęcherzyków - zacznij od pobrania odpowiedniej siatki mikroskopii elektronowej. Przygotuj siatkę za pomocą wyładowcy żarowego. Proces ten sprawia, że powierzchnia siatki jest hydrofilowa, co zapewnia lepszą przyczepność próbek.
Jednocześnie weź zawiesinę oczyszczonych egzosomów w probówce. Uzupełnij probówkę paraformaldehydem - utrwalaczem próbki - i inkubuj. Paraformaldehyd przenika do egzosomów i sieciuje białka i kwasy nukleinowe. Ten krok jest niezbędny do zachowania morfologii egzosomów.
Teraz załaduj zawiesinę egzosomu na wcześniej przygotowaną siatkę i inkubuj, aby umożliwić adsorpcję. Następnie dodaj kilka kropli octanu uranylu, plamy z ciężkiego metalu, na siatkę. Jony uranylowe wiążą się z białkami błonowymi i lipidami, tworząc osad wokół granicy egzosomu.
Na koniec umyj kratkę w wodzie, aby usunąć nadmiar plamy. Pozostaw siatkę do wyschnięcia i zobrazuj za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej lub TEM.
Kiedy wiązka elektronów uderza w egzosomy, plama otaczająca próbkę rozprasza więcej elektronów. Egzosomy mają mniejszą gęstość elektronów, przepuszczają wiązkę. Te różnie rozproszone elektrony są wychwytywane przez system obrazowania w celu utworzenia obrazu o wysokim kontraście.
Ujemnie zabarwione egzosomy wydają się jaśniejsze, z ciemną granicą wokół nich.
Aby wykonać barwienie negatywne, utrwal oczyszczone egzosomy po izolacji 1 mililitrem 2% paraformaldehydu przez 5 minut. Cienkie siatki miedziane EM pokryte folią formvar / węglową o oczkach 200 mesh należy traktować wyładowaniem jarzeniowym przez 1 minutę. Następnie załaduj od 5 do 7 mikrolitrów roztworu zawiesiny egzosomów na siatkę i inkubuj przez 1 minutę. Jeśli stężenie egzosomu jest zbyt wysokie, rozcieńczyć stężenie do odpowiedniego poziomu.
Natychmiast zabarwić egzosomy około 20 kroplami przefiltrowanego 1% roztworu octanu uranylu na powierzchni siatki EM. Usunąć nadmiar roztworu octanu uranylu z siatki, stykając krawędź siatki bibułą filtracyjną. Następnie szybko spłucz siatkę kroplą wody.
Użyj pęsety, aby umieścić siatkę na stole i częściowo przykryj siatkę naczyniem hodowlanym. Pozostaw siatkę do wyschnięcia na 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie zobrazuj siatkę lub przechowuj ją w pudełku z siatką mikroskopu elektronowego do przyszłych obserwacji.