Izolacja gruczołów dna żołądka: metoda izolowania gruczołów dna żołądka od ludzkiej tkanki żołądka

U ludzi dno oka jest najwyższą częścią żołądka. Nabłonek dna składa się z licznych gruczołów żołądkowych, które wydzielają sok żołądkowy, który pomaga w trawieniu.

Aby wyizolować gruczoły dna żołądka, zacznij od pobrania ludzkiej tkanki dna żołądka do zlewki. Dodać odpowiedni bufor do zlewki i energicznie przemyć tkankę dna. Mycie usuwa zanieczyszczenia i krew z tkanki dna.

Przenieś czystą tkankę na płytkę Petriego. Za pomocą sterylnej gazy zetrzyj ochronną warstwę śluzową, odsłaniając w ten sposób leżącą pod spodem warstwę nabłonka. Za pomocą kleszczy mocno zeskrob najwyższą warstwę nabłonka z tkanki.

Przenieś zeskrobany nabłonek na inną płytkę Petriego i zmiel go na mniejsze kawałki. Dodać zmielone kawałki do kolby zawierającej bufor uzupełniony enzymami kolagenazy. Inkubować w żądanej temperaturze ze stałym mieszaniem, aby zapobiec zbrylaniu.

Kolagenaza trawi białka macierzy zewnątrzkomórkowej obecne w warstwie nabłonka, uwalniając zdysocjowane gruczoły dna oka do zawiesiny. Przefiltrować zawiesinę do świeżej probówki, aby usunąć wszelkie niezdysocjowane grudki.

Utrzymuj przesącz gruczołowy w spokoju na lodzie, aby osadzać gruczoły. Odrzucić supernatant zawierający szczątki komórkowe i ponownie zawiesić osad gruczołowy w nowym buforze. Odwirować i przechowywać granulat gruczołowy do dalszego użycia.

Na początek zbierz przygotowaną tkankę do dużego plastikowego pojemnika wypełnionego DPBS bez wapnia/magnezu. Pozostaw plastikowy pojemnik na lodzie do czasu użycia. Następnie za pomocą kleszczy energicznie przemyj tkankę w sterylnej zlewce, zawierającej 100 mililitrów DPBS bez wapnia/magnezu, przez około 30 sekund. Następnie za pomocą sterylnej gazy zetrzyj warstwę śluzu z nabłonka.

Następnie użyj dużych kleszczy, aby mocno przytrzymać warstwę mięśniową tkanki. Następnie użyj dużych zakrzywionych kleszczy hemostatycznych i zeskrob nabłonek siłą. Przechowuj zeskrobany nabłonek na sterylnej polistyrenowej szalce Petriego. Aby zoptymalizować trawienie tkanek, zmiel tkankę nabłonkową na fragmenty. Następnie umyj tkankę bezwapniowo-magnezowym DPBS uzupełnionym antybiotykami.

Umyj wiele razy, aby usunąć krew. Wyrzuć pranie do zlewki na odpady. Następnie zbierz umyte fragmenty nabłonka w 125-mililitrowej szklanej kolbie okrągłodennej z 25-mililitrowym mieszadłem i wstępnie podgrzanym podłożem inkubacyjnym. Po zebraniu fragmentów tkanek należy uszczelnić kolbę okrągłodenną gumową przegrodą. Następnie włóż igłę rdzeniową 20G do przegrody. Podłącz przegrodę do zbiornika tlenu z gumowym wężem.

Włóż od 10 do 15 igieł odpływowych do przegrody, aby zapobiec jej pęknięciu, a następnie użyj zacisków, aby przymocować zestaw do stojaka pierścieniowego. Następnie włącz odpływ tlenu na niskim. Następnie skalibruj łaźnię wodną w temperaturze 37 stopni Celsjusza na płytce mieszającej przez 30 do 45 minut. Po kalibracji umieść zestaw w łaźni wodnej. Po 15 minutach inkubacji sprawdź, czy nie ma zdysocjowanych gruczołów.

Po pożądanym czasie inkubacji dodać 50 mililitrów podgrzanego DMEM/F-12 do pożywki inkubacyjnej za pomocą pipety serologicznej. Następnie przefiltruj uzyskaną mieszaninę gruczołów przez sterylną gazę w czterech 50-mililitrowych stożkowych probówkach. Następnie inkubować filtrat na lodzie przez 15 minut. Umożliwi to dławnicy osiądnięcie na dnie stożkowej rurki. Za pomocą pipety serologicznej usunąć 40 mililitrów supernatantu z górnej części zawiesiny gruczołu.

Pozostałe 10 mililitrów mieszaniny gruczołów zawiesić w 10 mililitrach DPBS uzupełnionych antybiotykami. Następnie rozprowadź całą mieszaninę w 5-mililitrowych probówkach do hodowli komórkowych. Odwirować probówki o masie 65 x g przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant.