Barwienie zewnątrzkomórkowego DNA: metoda identyfikacji zewnątrzkomórkowego DNA w skrawkach tkanki FFPE

Umierająca komórka uwalnia na zewnątrz komórkę fragment DNA zwany DNA zewnątrzkomórkowym. Aby wybarwić zewnątrzkomórkowe DNA, zacznij od pobrania utrwalonego w formalinie wycinka tkanki zatopionej w parafinie lub FFPE na szklanym szkiełku. Podgrzej szkiełko przez żądany czas. Ułatwia to przyleganie tkanki do powierzchni szkiełka i zmiękcza otaczającą parafinę.

Zanurz szkiełko w płynie deparafinowającym, aby całkowicie rozpuścić warstwę parafiny wokół tkanki. Następnie zanurz szkiełko w malejących stężeniach etanolu, aby ponownie nawodnić odparafinowaną tkankę. Po ponownym nawodnieniu zanurz szkiełko we wrzącym roztworze do pobierania antygenu. Zabieg ten demaskuje epitopy, które uległy zmianie podczas procesu utrwalania.

Nałóż na szkiełko przeciwciała pierwszorzędowe i pozwól im związać się ze specyficznymi, niezamaskowanymi epitopami obecnymi na komórce. Następnie dodaj znakowane fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowe, które wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi. Zanurz szkiełko w roztworze Sudan Black, aby zmniejszyć autofluorescencję tła.

Na koniec umieść kroplę podłoża montażowego uzupełnionego DAPI na wycinku tkanki i uszczelnij ją szkiełkiem nakrywkowym. Inkubuj, aby cząsteczki DAPI mogły zabarwić DNA. Wizualizacja przygotowanego wycinka tkanki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Znakowane fluorescencyjnie epitopy w komórce pomagają w różnicowaniu jądrowego DNA obecnego wewnątrz komórki od DNA zewnątrzkomórkowego.

W przypadku barwienia zewnątrzkomórkowego DNA, najpierw podgrzej próbki będące przedmiotem zainteresowania w stojaku na szkiełka w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 60 minut, a następnie zanurz szkiełka w dwóch 40-minutowych zmianach rozpuszczalnika w dygestorium. Po drugim zanurzeniu należy ponownie nawodnić próbki dwa razy w 100% etanolu i raz w 70% etanolu przez 5 minut na zabieg.

Po ostatnim zabiegu za pomocą szczypiec umieść szkiełka we wrzącym roztworze do pobierania antygenu w szybkowarze na wysokich obrotach przez 10 minut. Po zdemaskowaniu epitopów antygenu przenieś szybkowar z ognia do zlewu i natychmiast przelej pokrywę zimną wodą z kranu.

Pozostawić szkiełka do zrównoważenia przez 20 minut w roztworze do pobierania antygenu, a następnie przemyć próbki dwukrotnie w 0,01 molowym PBS na wytrząsarce orbitalnej przez 5 minut na przemycie. Po drugim umyciu użyj hydrofobowego pisaka, aby narysować kółka wokół próbek tkanki nerkowej i zablokuj wszelkie niespecyficzne barwienia 60 mikrolitrami 10% surowicy kurczaka w 5% albuminie surowicy bydlęcej przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji ostrożnie zastąp roztwór blokujący 60 mikrolitrami podstawowego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania w komorze wilgotnościowej przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnego ranka umyj szkiełka na wytrząsarce orbitalnej w PBS przez 2 minuty na mycie, a następnie dodaj 60 mikrolitrów odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluoroforem do każdego szkiełka na 40-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji umyć szkiełka w PBS, jak pokazano, a następnie poddać działaniu 0,3% Sudan Black w 70% etanolu, aby stłumić potencjalną autofluorescencję wywołaną formaliną. Po 30 minutach umyj szkiełka w wodzie z kranu, aby usunąć wszelkie osady i zanurz szkiełka w PBS na 10 minut, aby zapobiec dalszemu tworzeniu się osadu Sudan Black.

Pod koniec inkubacji zamontuj szkiełka na konfokalnych szklanych szkiełkach nakrywkowych z 360-mikrolitrowymi kroplami roztworu montażowego uzupełnionymi DAPI i uszczelnij szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci. Pozostaw szkiełka do utwardzenia przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Przechowuj je w temperaturze 4 stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem do czasu obrazowania za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej zgodnie ze standardowymi protokołami.