Pozyskiwanie ludzkich podocytów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych: procedura ukierunkowanego różnicowania dojrzałych podocytów nerkowych z komórek macierzystych

Dojrzałe komórki można przeprogramować, aby odzyskały stan niezróżnicowany i proliferacyjny podobny do komórek macierzystych. Te przeprogramowane komórki nazywane są indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi lub IPSC. Aby zróżnicować komórki pluripotencjalne w wyspecjalizowane w podocytach komórki zaangażowane w filtrację odpadów z nerek, zacznij od pobrania zawiesiny ludzkich IPSC w pożywce do indukcji mezodermy.

Przenieść tę zawiesinę na płytkę hodowlaną pokrytą matrycą podstawową i inkubować. Matryca podstawowa ułatwia przyleganie IPSC u podstawy. Następnie specyficzne czynniki obecne w pożywce indukują różnicowanie IPSC w komórki mezodermy, komórki prekursorowe dla podocytów. Odessać zużyty nośnik.

Uzupełnić płytkę pożądaną objętością pożywki do indukcji mezodermy i inkubować przez dłuższy czas. Ten etap prowadzi do różnicowania komórek mezodermalnych w niedojrzałe podocyty. Zastąp pośrednią pożywkę indukcyjną mezodermy roztworem trypsyny, aby oddzielić przylegające komórki od płytki.

Następnie odwirować w celu granulacji komórek. Odrzucić sklarowany osad zawierający roztwór trypsyny i fragmenty matrycy. Zawiesić osad w pożywce do indukcji podocytów. Przenieść zawiesinę komórkową na świeżo pokrytą płytkę hodowlaną. Inkubuj, aby umożliwić rozwój kilku wypustek przypominających stopy z komórek pośrednich, w wyniku czego powstają dojrzałe podocyty.

Po zliczeniu ponownie zawieś komórki do 1 razy 10 do piątych komórek na mililitr stężenia pożywki do indukcji mezodermy i odessaj roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej z płytek pokrytych matrycą błony podstawnej 2. Przepłukać płytki dwa razy ciepłym podłożem i wymieszać indukowaną przez człowieka zawiesinę pluripotencjalnych komórek macierzystych z delikatnym pipetowaniem.

Dodaj 1 mililitr komórek do każdej studzienki 12-dołkowych płytek z matrycą błony podstawnej pokrytej 2 i delikatnie potrząśnij płytkami, aby rozprowadzić komórki bardziej równomiernie. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. W dniach od 2 do 15 różnicowania zastąp pożywkę do indukcji mezodermy 1 mililitrem pożywki do indukcji mezodermy na dołek.

Jeśli obserwuje się znaczny wzrost komórek i szybkie wyczerpywanie się składników odżywczych, na co wskazuje żółknięcie pożywki, objętość pożywki do różnicowania mezodermy pośredniej można zwiększyć do 1,3 mililitra na studzienkę. W 16 dniu hodowli przepłukać pośrednie komórki mezodermy ciepłą pożywką i inkubować komórki z 500 mikrolitrami 0,05% trypsyny-EDTA na studzienkę przez 3 minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Kiedy komórki zaczną się dysocjować, zeskrob je podnośnikiem komórek i delikatnie wymieszaj komórki przez pipetowanie. Zatrzymaj reakcję za pomocą około 2 mililitrów roztworu neutralizującego trypsynę na studzienkę i przenieś komórki do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Doprowadzić objętość do 50 mililitrów za pomocą pożywki i zebrać komórki przez odwirowanie.

Ponownie zawiesić osad i pożywkę indukcyjną podocytów w stężeniu 1 razy 10 do piątej komórki na mililitr pożywki i dodać komórki do płytek pokrytych macierzą błony podstawnej 2. Następnie delikatnie potrząśnij płytką, aby pomóc w bardziej równomiernym rozprowadzeniu komórek i umieść je w inkubatorze na okres do 5 dni.

• Induced Pluripotent Stem Cells (IPSCs) - Reprogrammed mature cells with a proliferative, undifferentiated state similar to stem cells.
• Podocytes - Specialized cells involved in the filtration of waste from kidneys.
• Mesoderm Cells - Precursor cells for podocytes that are derived from IPSCs.
• Mature Podocytes - Fully developed podocytes, characterized by several foot-like projections.
• Directed Differentiation - A process of driving the development of undifferentiated cells into a specific cell type.

• Introduce Induced Pluripotent Stem Cells (IPSCs) - Cells which can be reprogrammed to regain a stem cell-like state (e.g., pluripotent).
• Key Concepts - Summarization of the steps from IPSCs to mature podocytes (e.g., directed differentiation of IPSCs, kidney mesoderm).
• Underlying Mechanisms - This involves various elements, such as media induction, cell incubation, and resuspension (e.g., deriving).
• Connect to Experiment - Understanding of how this process is valuable in studying kidney functions (e.g., podocytes kidney, normal human kidney podocytes).

• What are Induced Pluripotent Stem Cells (IPSCs) and how are they reprogrammed?
• What are podocytes and how do they function in the kidney?
• What is the process of deriving podocytes from mesoderm cells?

• Practical Applications - Generation of podocytes could be used in testing pharmaceutical effects on kidneys (e.g., kidney podocytes).
• Industry Impact - The research may offer new treatments for kidney-related diseases (e.g., human podocytes).
• Societal Importance - A better understanding of the IPSCs may revolutionize regenerative medicine (e.g., pluripotent).
• Link to Scientific Advancements - The evolution of technology that could manipulate cell development (e.g., directed differentiation of ipsc).