Dlaczego testowanie hipotezy zerowej jest istotne dla walidacji różnicowania podocytów?

Weryfikacja hipotezy zerowej jest niezbędna do ustalenia, czy obserwowane zmiany w charakterystyce podocytów wynikają z zastosowanego protokołu różnicowania, czy z przypadkowej zmienności, co zapewnia rzetelną walidację celu w badaniach nad nerkami.

Jak izolacja zmiennych niezależnych wpisuje się w schematy różnicowania iPSC w podocyty?

Izolowanie zmiennych, takich jak skład pożywki lub czas inkubacji, pozwala zespołom przypisać wyniki różnicowania konkretnie modyfikacjom protokołu, co usprawnia optymalizację na etapie odkryć oraz poprawia powtarzalność.

Co umożliwiają ilościowe pomiary podocytów w testach nefrotoksyczności?

Ilościowa ocena morfologii i żywotności podocytów umożliwia obiektywne porównanie wpływu związków, wspierając decyzje oparte na danych w badaniach przesiewowych pod kątem nefrotoksyczności oraz w opracowywaniu testów.

Dlaczego wymogi dotyczące powtórzeń są kluczowe w badaniach nad wielofunkcyjnymi podocytami?

Powtarzalność zapewnia spójność różnicowania podocytów i wyników analiz pomiędzy zespołami i eksperymentami, co ułatwia niezawodną wymianę danych oraz wspólne wysiłki w zakresie badań i rozwoju.

Jakie kompetencje w zakresie analizy statystycznej są wymagane przed wdrożeniem testu podocytów?

Do analizy efektywności różnicowania, powtarzalności testów oraz efektów traktowania niezbędne są solidne narzędzia statystyczne, które zapewnią, że dane oparte na podocytach spełniają standardy badawczo-rozwojowe przedsiębiorstw w zakresie podejmowania decyzji.

Pozyskiwanie ludzkich podocytów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych: procedura ukierunkowanego różnicowania dojrzałych podocytów nerkowych z komórek macierzystych

JoVE Encyclopedia of Experiments

Badania nad rakiem

0 wyświetleń • 4:19 min • April 30th, 2023

Dojrzałe komórki można przeprogramować, aby odzyskały stan niezróżnicowany i proliferacyjny podobny do komórek macierzystych. Te przeprogramowane komórki nazywane są indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi lub IPSC. Aby zróżnicować komórki pluripotencjalne w wyspecjalizowane w podocytach komórki zaangażowane w filtrację odpadów z nerek, zacznij od pobrania zawiesiny ludzkich IPSC w pożywce do indukcji mezodermy.

Przenieść tę zawiesinę na płytkę hodowlaną pokrytą matrycą podstawową i inkubować. Matryca podstawowa ułatwia przyleganie IPSC u podstawy. Następnie specyficzne czynniki obecne w pożywce indukują różnicowanie IPSC w komórki mezodermy, komórki prekursorowe dla podocytów. Odessać zużyty nośnik.

Uzupełnić płytkę pożądaną objętością pożywki do indukcji mezodermy i inkubować przez dłuższy czas. Ten etap prowadzi do różnicowania komórek mezodermalnych w niedojrzałe podocyty. Zastąp pośrednią pożywkę indukcyjną mezodermy roztworem trypsyny, aby oddzielić przylegające komórki od płytki.

Następnie odwirować w celu granulacji komórek. Odrzucić sklarowany osad zawierający roztwór trypsyny i fragmenty matrycy. Zawiesić osad w pożywce do indukcji podocytów. Przenieść zawiesinę komórkową na świeżo pokrytą płytkę hodowlaną. Inkubuj, aby umożliwić rozwój kilku wypustek przypominających stopy z komórek pośrednich, w wyniku czego powstają dojrzałe podocyty.

Po zliczeniu ponownie zawieś komórki do 1 razy 10 do piątych komórek na mililitr stężenia pożywki do indukcji mezodermy i odessaj roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej z płytek pokrytych matrycą błony podstawnej 2. Przepłukać płytki dwa razy ciepłym podłożem i wymieszać indukowaną przez człowieka zawiesinę pluripotencjalnych komórek macierzystych z delikatnym pipetowaniem.

Dodaj 1 mililitr komórek do każdej studzienki 12-dołkowych płytek z matrycą błony podstawnej pokrytej 2 i delikatnie potrząśnij płytkami, aby rozprowadzić komórki bardziej równomiernie. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. W dniach od 2 do 15 różnicowania zastąp pożywkę do indukcji mezodermy 1 mililitrem pożywki do indukcji mezodermy na dołek.

Jeśli obserwuje się znaczny wzrost komórek i szybkie wyczerpywanie się składników odżywczych, na co wskazuje żółknięcie pożywki, objętość pożywki do różnicowania mezodermy pośredniej można zwiększyć do 1,3 mililitra na studzienkę. W 16 dniu hodowli przepłukać pośrednie komórki mezodermy ciepłą pożywką i inkubować komórki z 500 mikrolitrami 0,05% trypsyny-EDTA na studzienkę przez 3 minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Kiedy komórki zaczną się dysocjować, zeskrob je podnośnikiem komórek i delikatnie wymieszaj komórki przez pipetowanie. Zatrzymaj reakcję za pomocą około 2 mililitrów roztworu neutralizującego trypsynę na studzienkę i przenieś komórki do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Doprowadzić objętość do 50 mililitrów za pomocą pożywki i zebrać komórki przez odwirowanie.

Ponownie zawiesić osad i pożywkę indukcyjną podocytów w stężeniu 1 razy 10 do piątej komórki na mililitr pożywki i dodać komórki do płytek pokrytych macierzą błony podstawnej 2. Następnie delikatnie potrząśnij płytką, aby pomóc w bardziej równomiernym rozprowadzeniu komórek i umieść je w inkubatorze na okres do 5 dni.