JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:45 min. • April 30th, 2023
Komórki mięśni gładkich wypieracza (DSM) obecne w ścianie pęcherza moczowego stanowią podstawową jednostkę funkcjonalną pęcherza moczowego. Komórki te rozluźniają się, aby ułatwić magazynowanie moczu w pęcherzu i kurczą się, aby uwolnić mocz.
Aby wyizolować komórki DSM, zacznij od pobrania pobranej próbki ludzkiego pęcherza moczowego. Umyj próbkę, aby usunąć wszelkie ślady krwi i zanieczyszczeń. Następnie zabezpiecz tkankę powierzchnią błony śluzowej skierowaną do góry. Wytnij tłuszcz, naczynia krwionośne i warstwę błony śluzowej, aby odsłonić leżącą pod spodem warstwę mięśni wypieracza. Następnie pokrój tkankę pozbawioną błony śluzowej na małe fragmenty.
Potraktuj fragmenty tkanek koktajlem trawiennym zawierającym papainę i inkubuj. Papaina, enzym proteolityczny, wspomaga trawienie białek w macierzy zewnątrzkomórkowej, które utrzymują komórki razem i inicjują rozluźnienie komórek w macierzy. Teraz usuń supernatant zawierający papainę.
Dodać zawiesinę enzymu kolagenazy do fragmentów tkanek i inkubować w temperaturze fizjologicznej. Kolagenaza rozbija macierz zewnątrzkomórkową i ułatwia dysocjację komórek DSM. Inkubacja w temperaturze fizjologicznej pomaga zachować integralność komórek DSM. Odrzucić supernatant zawierający kolagenazę.
Umyj fragmenty tkanek lodowatym buforem, aby usunąć wszelkie pozostałości enzymów. Następnie ponownie umieść je w buforze. Delikatnie rozcierać fragmenty tkanek poddane działaniu enzymu, aby zapewnić całkowitą dysocjację wszelkich nieuwolnionych komórek i uzyskać jednokomórkową zawiesinę komórek DSM. Przechowuj ogniwa DSM w niskich temperaturach do czasu dalszego użycia.
Rozpocznij od zbadania próbki pęcherza moczowego o całej grubości. Przypnij próbkę, błoną śluzową skierowaną do góry i surowicą w dół, na pokrytym silikonowym enancjomerem okrągłym naczyniu wypełnionym lodowatym DS i ostrożnie usuń całą błonę śluzową przez ostre rozwarstwienie.
Wytnij kilka pozbawionych błony śluzowej wypieracza, mięśni gładkich lub kawałków DSM. Umieść od 3 do 6 kawałków DSM w probówce z 1 do 2 mililitrami wstępnie podgrzanego DS zawierającego papainę i ditiotreitol lub DS-P. Inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 45 minut, potrząsając probówką co 10 do 15 minut.
Po inkubacji wyjmij DS-P z probówki i krótko umyj kawałki DSM lodowatym DS. Przenieś DS z kawałkami DSM do nowej probówki i wyjmij DS, pozostawiając kawałki DSM na dnie tuby. Dodać 1 do 2 mililitrów DS zawierającego kolagenazę typu II lub DS-C do probówki i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, od czasu do czasu wstrząsając.
Wyrzuć DS-C i umyj kawałki DSM poddane działaniu enzymów 5 do 10 razy lodowatym DS. Po ostatnim praniu pozostaw DS w tubie i delikatnie rozetrzyj kawałki wypolerowaną na ogniowo pipetą Pasteura, aby uwolnić pojedyncze komórki DSM.