JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 2:42 min • April 30th, 2023
Sferoidy nowotworowe to trójwymiarowe agregaty komórkowe komórek nowotworowych. Te sferoidy mogą być osadzone w macierzy kolagenowej, co powoduje tworzenie się bloków sferoidalnych. Aby błyskawicznie zamrozić blok sferoidalny, zacznij od umieszczenia sferoidalnego bloku żelu kolagenowego w środku formy histologicznej.
Przepłucz blok odpowiednim buforem i uzupełnij pleśń roztworem utrwalającym. Inkubować, aby ten roztwór mógł przeniknąć do sferoid i usieciować białka komórkowe. Ten krok pomaga utrzymać strukturę sferoidalną przed kolejnym zabiegiem. Następnie odessać roztwór utrwalający
.Umieść blok żelu sferoidalnego w świeżej formie histologicznej zawierającej cienką warstwę podłoża do zatapiania. Pokryj go większą ilością podłoża do zatapiania, aby całkowicie zanurzyć blok sferoidalny. Na koniec zanurz formę w kąpieli ciekłego azotu na krótki czas.
Szybkie zamrażanie zapobiega tworzeniu się większych kryształków lodu w sferoidach. Pomaga w zachowaniu integralności sferoidalnej bez powodowania uszkodzeń mechanicznych. Gdy warstwa podłoża do zatapiania zestali się wokół bloku sferoidalnego, usuń zamrożony blok z formy. Zamrożony blok sferoidalny należy przechowywać w niskich temperaturach do dalszej analizy histologicznej.
Najpierw użyj małych kleszczyków, aby podnieść blok żelu kolagenowego i sferoidy ze szkiełka komory. Następnie umieść blok żelu kolagenowego w plastikowej formie histologicznej. Krótko spłucz blok żelu kolagenowego 1X PBS i utrwal go 4% PFA w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj blok żelu kolagenowego 1,5 mililitra 1X PBS na shakerze przez 15 minut.
Nałóż cienką warstwę związku OCT na dno nowej plastikowej formy histologicznej. Następnie umieść utrwalony i umyty blok żelu kolagenowego na wierzchu związku OCT, a następnie ostrożnie wypełnij resztę formy związkiem OCT. Trzymaj formę w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 1 godzinę. Następnie błyskawicznie zamroź formę na 100-milimetrowej szalce Petriego unoszącej się na ciekłym azocie i przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.