Izolacja egzosomów: technika ultrawirowania oparta na gęstości wykorzystująca poduszkę sacharozy do oddzielania egzosomów od kondycjonowanych pożywek hodowanych komórek

Egzosomy - nano-rozmiarowe, połączone błoną pęcherzyki, które przenoszą funkcjonalne biomolekuły - są aktywnie wydzielane przez większość typów komórek i mogą być izolowane z supernatantów do hodowli komórkowych in vitro. Aby wyizolować egzosomy, najpierw zbierz supernatant lub kondycjonowane podłoże z hodowli komórkowej, która Cię interesuje. Kondycjonowane podłoże zawierałoby egzosomy, białka, szczątki komórkowe i pęcherzyki.

Odwirować pożywkę, aby osadzać resztki komórkowe. Zbierz supernatant zawierający egzosom i przefiltruj go przez sitka komórkowe, aby usunąć większe pęcherzyki. Przenieś określoną objętość przefiltrowanego medium do świeżej probówki. Następnie należy wymieszać odpowiednie stężenia sacharozy i tlenku deuteru, aby przygotować poduszkę sacharozową - nieciągły gradient sacharozy.

Dodać określoną objętość roztworu poduszki sacharozowej do probówki zawierającej pożywkę; roztwór tworzy oddzielną warstwę na dnie. Teraz odwiruj probówkę z dużą prędkością. Poduszka sacharozowa ułatwia migrację egzosomów z pożywki do roztworu sacharozy przy jednoczesnym zachowaniu integralności egzosomu. Zanieczyszczenia białkowe o dużej gęstości zajmują granicę faz między roztworem sacharozy a pożywką.

Ostrożnie przenieś główną frakcję warstwy sacharozy zawierającej egzosomy do świeżej probówki z odpowiednim buforem. Wirować z dużą prędkością, aby uzyskać osad oczyszczonych egzosomów. Odrzucić sklarowany sacharozę szwarodek wraz z wszelkimi zanieczyszczeniami białkowymi. Ponownie zawiesić osad egzosomu w buforze i przechowywać w niskich temperaturach do dalszego użycia.

Aby wstępnie oczyścić zebrane kondycjonowane podłoże, odwiruj je przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Przenieść supernatant do nowej probówki i wyrzucić osad. Po powtórzeniu tego etapu wirowania z odzyskanym supernatantem, ponownie odzyskać supernatant i wyrzucić osad.

Następnie odwirować odzyskany supernatant w temperaturze 2 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Zachować supernatant i wyrzucić osad. Przefiltrować supernatant raz przez filtr 0,22 mikrometra podłączony do 20-mililitrowej strzykawki do świeżej probówki wirówkowej.

Tymczasem, aby przygotować 25% roztwór sacharozy w tlenku deuteru, dokładnie odważ 1,9 grama sacharozy w uniwersalnej probówce. Następnie dodaj tlenek deuteru, aż waga osiągnie 7,6 grama. Następnie napełnij probówkę ultrawirówkową 22,5 mililitrami wstępnie oczyszczonego, kondycjonowanego podłoża.

Umieść szklaną pipetę w probówce. Dodaj 3 mililitry roztworu sacharozy przez pipetę, tak aby roztwór utworzył oddzielną warstwę pod kondycjonowanym podłożem. Ostrożnie umieścić probówkę zawierającą warstwowo kondycjonowany roztwór sacharozy w wiadrze odchylanego wirnika.

Zamocuj łyżkę w wirniku. Umieść rotor w ultrawirówce i wiruj nim 100 000 x g w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 1,5 godziny. Zebrać 2 mililitry warstwy sacharozy z probówki, po 1 mililitrze na raz, za pomocą pipety P1000 z końcówką przymocowaną do końcówki o pojemności 10 mikrolitrów i dodać ją do butelki ultrawirówki zawierającej 20 mililitrów przefiltrowanego PBS do mycia.

Umieść probówkę w wirniku o stałym kącie nachylenia i odwiruj ją przy 100 000 x g w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 1,5 godziny. Użyj 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby ostrożnie usunąć supernatant. Zawiesić osad z 400 mikrolitrami przefiltrowanego PBS.