JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:04 min. • April 30th, 2023
Egzosomy - nano-rozmiarowe pęcherzyki błonowe pochodzenia komórkowego - wykazują potencjał jako terapeutyczne nośniki dla dwuniciowych małych interferujących RNA lub siRNA.
Po uwolnieniu do cytoplazmy komórki docelowej siRNA wiąże się z kompleksem wyciszającym indukowanym przez RNA. Aktywowany kompleks następnie rozpoznaje i wiąże się ze specyficznym mRNA, negatywnie regulując jego ekspresję i pośrednicząc w wyciszaniu genów.
Aby zakapsułkować siRNA w egzosomach, najpierw schłodzić kuwetę do elektroporacji na lodzie. Następnie wymieszaj egzosomy i specyficzne siRNA w probówce w żądanym stosunku za pomocą odpowiedniego buforu do elektroporacji. Teraz przenieś tę mieszaninę do wstępnie schłodzonej kuwety.
Zamknij kuwetę i umieść ją w uchwycie kuwety elektroporatora. Obróć pokrętło obrotowe, aby upewnić się, że kuweta styka się z elektrodami elektroporacyjnymi. Teraz uruchom wybrany program do elektroporacji.
Podczas elektroporacji impulsy elektryczne zaburzają dwuwarstwę fosfolipidową egzosomów zawieszonych w buforze przewodzącym. Powoduje to tworzenie się przejściowych porów w błonie egzosomu, sprzyjających dyfuzji siRNA do pęcherzyka. Bufor pomaga zapobiegać agregacji siRNA.
Po zakończeniu elektroporacji pory ponownie się zamykają, zatrzymując w nich siRNA. Na koniec wyjmij kuwetę z elektroporatora i przenieś mieszaninę do świeżej probówki. Przechowuj egzosomy zamknięte w siRNA w niskich temperaturach do czasu dalszego użycia.
Przed rozpoczęciem elektroporacji należy wstępnie schłodzić kuwetę do elektroporacji na lodzie przez 30 minut. Wymieszaj 7 mikrogramów egzosomów z 0,33 mikrograma siRNA w probówce do mikrowirówki. Dodaj bufor kwasu cytrynowego, aby uzyskać objętość 150 mikrolitrów. Dodaj mieszaninę egzosom-siRNA do kuwety do elektroporacji za pomocą plastikowej pipety i nakręć kuwetę.
Umieść kuwetę we właściwej orientacji w uchwycie kuwety elektroporatora i obróć pokrętło elektroporatora o 180 stopni zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Wybierz żądany program i naciśnij przycisk Start, aby rozpocząć elektroporację. Wyświetlacz wskaże udany impuls.
Następnie obróć koło o 180 stopni w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara i wyjmij kuwetę. Użyj plastikowej pipety, aby wyjąć próbkę z kuwety do nowej probówki do mikrowirówki. Przechowuj tubkę na lodzie lub w lodówce przed dalszą obróbką, jeśli nie zostanie natychmiast użyta.