JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:36 min. • April 30th, 2023
Aby dostarczyć plazmidowe DNA bezpośrednio do komórek nerkowych myszy, zacznij od umieszczenia znieczulonej myszy w pozycji bocznej. Przygotuj mysz, usuwając jej futro grzbietowe z boku. Zlokalizuj odpowiednie miejsce nacięcia na lewym boku, poniżej klatki piersiowej.
Zrób małą szczelinę w skórze i leżących pod nią warstwach mięśni. Następnie delikatnie uciskaj jamę brzuszną, aby odsłonić nerkę przez miejsce nacięcia. Częściowo usuń nakładającą się tkankę tłuszczową okołonerkową, aby uwidocznić miedniczkę nerkową.
Teraz weź strzykawkę zawierającą plazmidowe DNA w hydrodynamicznym buforze dostarczającym. Wbij igłę bezpośrednio do miedniczki nerkowej - trójkątnej, rozszerzonej części moczowodu w nerce. Szybko wstrzyknąć roztwór plazmidu tak, aby DNA bezpośrednio dotarło do miąższu nerki - funkcjonalnej części nerki, która filtruje krew.
Szybkie dostarczanie dużej objętości płynu przez miedniczkę nerkową wytwarza wysokie ciśnienie, tworząc przejściowe pory w błonie komórkowej komórek miąższowych nerek. Ułatwia to wnikanie plazmidów do komórek. W końcu pory te zamykają się, więżąc plazmidy w komórkach.
Na koniec wycofaj igłę i wróć nerkę do jamy brzusznej. Zszyj warstwy skóry i mięśni w miejscu nacięcia.
Załóż sterylne rękawice chirurgiczne i zaczynając od strony nacięcia, przetrzyj zwierzę nowym wacikiem z chlorheksydyną/alkoholem trzy razy okrężnymi ruchami. Teraz zlokalizuj miejsce nacięcia. Uszczypnij skórę pęsetą i za pomocą nożyczek odetnij warstwę skóry około 1 centymetra od kręgosłupa poniżej klatki piersiowej. Wykonaj kolejne środkowe cięcie poniżej w warstwie mięśni. Zlokalizuj nerkę i nie dotykając jej, delikatnie odsłoń ją od jamy brzusznej, wywierając stały, delikatny nacisk palcami na brzuch.
Odsłonięcie nerki jest czasami trudne. Delikatnie uciskaj brzuch i kręgosłup, aby uniknąć uszkodzenia śledziony. Jeśli wyjdą narządy inne niż nerka, w razie potrzeby delikatnie przywróć je z powrotem do jamy ciała za pomocą zamkniętych kleszczy.
Następnie delikatnie oddziel nerkę od otaczającego tłuszczu na tyle, aby uwidocznić miedniczkę nerkową, która może być widoczna jako mała biała kropka. Po uwidocznieniu miedniczki nerkowej użyj zamkniętych kleszczy, aby nacisnąć na prawą stronę nerki, tak aby miedniczka nerkowa pozostała w zasięgu wzroku. Następnie chwyć załadowaną strzykawkę insulinową w prawą rękę, trzymając ją równolegle do powierzchni roboczej i ostrożnie włóż igłę do miedniczki nerkowej.
Po wkłuciu igły należy szybko wstrzyknąć roztwór w ciągu 3 sekund. Pozostaw igłę na miejscu przez około 10 sekund, aby zapobiec cofaniu się roztworu. Następnie powoli i ostrożnie wyjmij igłę i przywróć narząd do jamy brzusznej, delikatnie rozciągając miejsce nacięcia za pomocą zamkniętych kleszczy. Teraz zszyj warstwę mięśniową za pomocą 5-0 wchłanialnych szwów i umieść od 2 do 4 niezależnych węzłów. Podobnie zszyj warstwę skóry niewchłanialnymi nylonowymi szwami 5-0 lub 6-0 i umieść od 2 do 4 niezależnych węzłów.