Analiza ekspresji białek oparta na macierzach białek w odwróconej fazie: procedura jednoczesnej kwantyfikacji ekspresji wielu białek z lizatu komórkowego

Próbka guza zawiera niejednorodną populację białek. Za pomocą lizatu nowotworowego można równolegle analizować wiele takich białek w celu zidentyfikowania białka będącego przedmiotem zainteresowania. Ta wysokoprzepustowa technika nazywa się macierzami białek z odwróconą fazą lub RPPA.

Aby wykonać RPPA, zacznij od pobrania szkiełka do testu immunologicznego pokrytego nitrocelulozą. Zauważ szereg białek lizatu guza na szkiełku. Inkubować, aby umożliwić wychwyt białka na nitrocelulozie. Następnie należy potraktować szkiełko buforem blokującym, który blokuje niespecyficzne miejsca wiązania przeciwciał na białkach.

Usuń nadmiar roztworu blokującego. Teraz zamontuj szkiełko pokryte białkiem w uchwycie i szczelnie go zamknij. W ten sposób powstają tymczasowe studzienki nad powierzchnią zjeżdżalni. Następnie załaduj studzienki pierwszorzędowym roztworem przeciwciał. Przeciwciała te rozpoznają epitopy obecne na odpowiednim celu z mieszaniny białek na tablicy.

Na koniec dodaj znakowane fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowe. Przeciwciała te przyłączają się do wstępnie związanych przeciwciał pierwotnych, tworząc kompleks. Umyć szkiełko w celu usunięcia wszelkich niezwiązanych przeciwciał drugorzędowych. Odpiąć szkiełko od uchwytu i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.

Zeskanuj szkiełko za pomocą skanera fluorescencyjnego. Białka docelowe znakowane przeciwciałami fluoryzują na określonej długości fali i pojawiają się jako kolorowe plamki na powierzchni szkiełka.

Przed drukowaniem RPPA z każdej próbki wykonuje się serię pięciu dwukrotnych rozcieńczeń. Jednym z najbardziej czasochłonnych aspektów tej procedury jest wykonanie setek rozcieńczeń. Pomyślny wynik można zapewnić poprzez dwukrotne sprawdzenie przed wydrukowaniem slajdów.

Skaner robotyczny MicroGrid II jest następnie wykorzystywany do wykrywania lizatów białkowych na szkiełkach szklanych pokrytych nitrocelulozą. Każda próbka jest oznaczana w trzech egzemplarzach, co daje w sumie 15 plamek na próbkę. Szkiełka użyte w tym eksperymencie zawierają dwie elektrody, na których nakrapiane są próbki. Na każdym klocku wykryto identyczne próbki, w tym przypadku 100 próbek. Inne dostępne formaty to prowadnice z 1, 8 i 16 padami. Im większa liczba elektrod, tym mniejsza liczba próbek, które można dostrzec na każdej z nich.

Aby rozpocząć procedurę wykrywania białek, należy zwilżyć szkiełka w nadmiarze buforu blokującego i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę na platformie kołyszącej. Przygotować 800 mikrolitrów przeciwciał pierwszorzędowych w buforze blokującym w pożądanych stężeniach i przechowywać na lodzie. Po godzinnej inkubacji w buforze blokującym, zamontuj szkiełka w jednoramkowym klipsie Chip Clip lub czterokieszeniowym uchwycie prowadnicy FastFrame, tak aby między szkiełkiem a komorą inkubacyjną powstało szczelne uszczelnienie.

Usuń pozostały bufor z dołków i dodaj 600 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego do odpowiednich studzienek. Umieść szkiełka i komorę w szczelnie zamkniętym mokrym pudełku i inkubuj na bujanej platformie przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnego ranka wyjmij szkiełka z chłodni. Ostrożnie usuń pierwotne przeciwciała z każdej studzienki. Dodaj 600 mikrolitrów 0,1% PBS-Tween20 lub PBS-T i myj szkiełka na bujanej platformie w temperaturze pokojowej przez 5 minut.

Wymień PBS-T na nowy PBS-T. W ten sposób mycie szkiełka w sumie trzy razy. Usunąć bufor ze studzienek i dodać 600 mikrolitrów znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał drugorzędowych w odpowiednim rozcieńczeniu do odpowiednich studzienek. Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi w temperaturze pokojowej przez 45 minut, delikatnie wstrząsając. Ważne jest, aby chronić membranę przed światłem do czasu jej skanowania. Po 45 minutach usuń przeciwciała wtórne ze studzienek i krótko umyj trzykrotnie w 600 mikrolitrach PBS-T w temperaturze pokojowej.

Wyjmij szkiełka z nośnika, przenieś do odpowiedniego pojemnika i myj nadmiar PBS-T przez 15 minut, utrzymując membranę w ciemności. Usuń PBS-T i umyj membranę PBS w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby usunąć resztki Tween20, ponownie utrzymując membranę w ciemności. Suszyć Fastslides w piekarniku w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 10 minut. Na koniec zeskanuj szkiełka w 680 nanometrach i/lub 800 nanometrach, w zależności od użytych przeciwciał drugorzędowych.