Analiza ekspresji białek oparta na macierzach białek w odwróconej fazie: procedura jednoczesnej kwantyfikacji ekspresji wielu białek z lizatu komórkowego

Próbka guza zawiera niejednorodną populację białek. Za pomocą lizatu nowotworowego można równolegle analizować wiele takich białek w celu zidentyfikowania białka będącego przedmiotem zainteresowania. Ta wysokoprzepustowa technika nazywa się macierzami białek z odwróconą fazą lub RPPA.

Aby wykonać RPPA, zacznij od pobrania szkiełka do testu immunologicznego pokrytego nitrocelulozą. Zauważ szereg białek lizatu guza na szkiełku. Inkubować, aby umożliwić wychwyt białka na nitrocelulozie. Następnie należy potraktować szkiełko buforem blokującym, który blokuje niespecyficzne miejsca wiązania przeciwciał na białkach.

Usuń nadmiar roztworu blokującego. Teraz zamontuj szkiełko pokryte białkiem w uchwycie i szczelnie go zamknij. W ten sposób powstają tymczasowe studzienki nad powierzchnią zjeżdżalni. Następnie załaduj studzienki pierwszorzędowym roztworem przeciwciał. Przeciwciała te rozpoznają epitopy obecne na odpowiednim celu z mieszaniny białek na tablicy.

Na koniec dodaj znakowane fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowe. Przeciwciała te przyłączają się do wstępnie związanych przeciwciał pierwotnych, tworząc kompleks. Umyć szkiełko w celu usunięcia wszelkich niezwiązanych przeciwciał