$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Patologia ekspansji (ExPath) to technika przygotowania próbek biologicznych, która umożliwia konwencjonalnej mikroskopii świetlnej obrazowanie struktur w skali nano poprzez ich rozszerzanie za pomocą systemu polimerowego.
Najpierw weź przetworzoną próbkę tkanki barwionej immunologicznie i przykryj ją roztworem kotwiczącym zawierającym zarówno grupy białkowe, jak i reagujące z polimerami. Grupa reagująca z białkiem odczynnika kotwiczącego wiąże się z aminami biomolekuł w komórkach.
Następnie dodać odpowiedni roztwór żelujący na próbkę i inkubować, aby umożliwić jego dyfuzję wewnątrz tkanki. Grupa reagująca z polimerem odczynnika kotwiącego wiąże się z wolnymi monomerami w roztworze żelującym, umożliwiając biomolekułom zakotwiczenie się w polimerze podczas jego polimeryzacji.
Po zakończeniu polimeryzacji próbki przykryj szkiełko roztworem proteinazy. Proteinazy trawią białka cytoszkieletu w celu usunięcia oporu strukturalnego, umożliwiając komórkom rozszerzanie się bez pękania. Po trawieniu enzymatycznym zżelowana próbka odrywa się od szkiełka i przemieszcza się do zawiesiny.
Teraz przenieś próbkę do odpowiedniego bufora do płukania w pojemniku kompatybilnym z mikroskopem. Następnie zastąp bufor wodą i inkubuj. Polimer pochłania ogromną ilość wody w stosunku do swojej masy i pęcznieje.
W miarę rozszerzania się polimeru biomolekuły zakotwiczone w sieci polimerowej oddalają się od siebie, zachowując swoją orientację przestrzenną. Pozwala to na ich łatwą wizualizację pod konwencjonalnym mikroskopem świetlnym.
Przygotuj roztwór kotwiący zgodnie z instrukcjami rękopisu. Umieść szkiełka na 100-milimetrowej szalce Petriego. Odpipetować roztwór kotwiczący na tkance i inkubować je przez co najmniej 3 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj roztwór żelujący zgodnie ze wskazówkami rękopisu.
Usunąć nadmiar roztworu zakotwiczającego z sekcji tkankowej i umieścić szkiełko z powrotem na szalce Petriego. Dodać świeży zimny roztwór żelujący do próbki i inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Aby zbudować komorę na szkiełku wokół próbki, należy utworzyć przekładki, cienko wycinając kawałki szkła nakrywkowego nożem diamentowym. Zabezpiecz przekładki po obu stronach chusteczki wodą i ostrożnie umieść szklaną pokrywę na szkiełku, uważając, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza na chusteczce.
Następnie inkubuj próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym środowisku przez 2 godziny. Zdejmij pokrywę komory żelowania, delikatnie wsuwając żyletkę pod szkiełko nakrywkowe i powoli podnosząc ją z powierzchni żelu. Przytnij czysty żel wokół tkanki, aby zminimalizować objętość, upewniając się, że żel jest cięty asymetrycznie, aby śledzić orientację.
Rozcieńczyć proteinazę K w stosunku 1:200 w buforze wytrawiającym, upewniając się, że przygotowałeś wystarczającą ilość roztworu, aby całkowicie zanurzyć żel. Następnie inkubować próbkę z roztworem w zamkniętym pojemniku przez 3 godziny w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Jeśli próbka nie odrywa się podczas trawienia, użyj żyletki, aby delikatnie ją usunąć.
Użyj miękkiego pędzla, aby przenieść próbkę do 1X PBS w pojemniku zgodnym z żądanym systemem obrazowania i wystarczająco dużym, aby pomieścić w pełni rozprężony żel. Umyj próbkę w PBS przez 10 minut, a w razie potrzeby zregeneruj ją 300-milimolowym DAPI. Rozszerzyć próbki, przemywając próbkę nadmiarem objętości podwójnie destylowanej wody 3 do 5 razy przez 10 minut na płukanie. Następnie wykonaj obrazowanie fluorescencyjne.