Patologia ekspansji: metoda obrazowania optycznego w wysokiej rozdzielczości klinicznych próbek tkanek

0 views • 4:14 min • April 30th, 2023

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patologia ekspansji (ExPath) to technika przygotowania próbek biologicznych, która umożliwia konwencjonalnej mikroskopii świetlnej obrazowanie struktur w skali nano poprzez ich rozszerzanie za pomocą systemu polimerowego.

Najpierw weź przetworzoną próbkę tkanki barwionej immunologicznie i przykryj ją roztworem kotwiczącym zawierającym zarówno grupy białkowe, jak i reagujące z polimerami. Grupa reagująca z białkiem odczynnika kotwiczącego wiąże się z aminami biomolekuł w komórkach.

Następnie dodać odpowiedni roztwór żelujący na próbkę i inkubować, aby umożliwić jego dyfuzję wewnątrz tkanki. Grupa reagująca z polimerem odczynnika kotwiącego wiąże się z wolnymi monomerami w roztworze żelującym, umożliwiając biomolekułom zakotwiczenie się w polimerze podczas jego polimeryzacji.

Po zakończeniu polimeryzacji próbki przykryj szkiełko roztworem proteinazy. Proteinazy trawią białka cytoszkieletu w celu usunięcia oporu strukturalnego, umożliwiając komórkom rozszerzanie się bez pękania. Po trawieniu enzymatycznym zżelowana próbka odrywa się od szkiełka i przemieszcza się do zawiesiny.

Teraz przenieś próbkę do odpowiedniego bufora do płukania w pojemniku kompatybilnym z mikroskopem. Następnie zastąp bufor wodą i inkubuj. Polimer pochłania ogromną ilość wody w stosunku do swojej masy i pęcznieje.

W miarę rozszerzania się polimeru biomolekuły zakotwiczone w sieci polimerowej oddalają się od siebie, zachowując swoją orientację przestrzenną. Pozwala to na ich łatwą wizualizację pod konwencjonalnym mikroskopem świetlnym.

Przygotuj roztwór kotwiący zgodnie z instrukcjami rękopisu. Umieść szkiełka na 100-milimetrowej szalce Petriego. Odpipetować roztwór kotwiczący na tkance i inkubować je przez co najmniej 3 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj roztwór żelujący zgodnie ze wskazówkami rękopisu.

Usunąć nadmiar roztworu zakotwiczającego z sekcji tkankowej i umieścić szkiełko z powrotem na szalce Petriego. Dodać świeży zimny roztwór żelujący do próbki i inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Aby zbudować komorę na szkiełku wokół próbki, należy utworzyć przekładki, cienko wycinając kawałki szkła nakrywkowego nożem diamentowym. Zabezpiecz przekładki po obu stronach chusteczki wodą i ostrożnie umieść szklaną pokrywę na szkiełku, uważając, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza na chusteczce.

Następnie inkubuj próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym środowisku przez 2 godziny. Zdejmij pokrywę komory żelowania, delikatnie wsuwając żyletkę pod szkiełko nakrywkowe i powoli podnosząc ją z powierzchni żelu. Przytnij czysty żel wokół tkanki, aby zminimalizować objętość, upewniając się, że żel jest cięty asymetrycznie, aby śledzić orientację.

Rozcieńczyć proteinazę K w stosunku 1:200 w buforze wytrawiającym, upewniając się, że przygotowałeś wystarczającą ilość roztworu, aby całkowicie zanurzyć żel. Następnie inkubować próbkę z roztworem w zamkniętym pojemniku przez 3 godziny w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Jeśli próbka nie odrywa się podczas trawienia, użyj żyletki, aby delikatnie ją usunąć.

Użyj miękkiego pędzla, aby przenieść próbkę do 1X PBS w pojemniku zgodnym z żądanym systemem obrazowania i wystarczająco dużym, aby pomieścić w pełni rozprężony żel. Umyj próbkę w PBS przez 10 minut, a w razie potrzeby zregeneruj ją 300-milimolowym DAPI. Rozszerzyć próbki, przemywając próbkę nadmiarem objętości podwójnie destylowanej wody 3 do 5 razy przez 10 minut na płukanie. Następnie wykonaj obrazowanie fluorescencyjne.

17:08

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

Related Videos

0 Views

07:26

Obrazowanie pojedynczej cząsteczki w superrozdzielczości 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu w błonie plazmatycznej za pomocą nowatorskich sond fluorescencyjnych

Related Videos

0 Views

06:18

Obrazowanie białek podocytarnych nefryny, aktyny i podocyny za pomocą mikroskopii ekspansyjnej

Related Videos

0 Views

13:49

Mikroendoskopia światłowodowa o wysokiej rozdzielczości do obrazowania komórkowego in situ

Related Videos

0 Views

11:45

Generowanie i 3-wymiarowa ocena ilościowa zmian w tętnicach u myszy za pomocą optycznej tomografii projekcyjnej

Related Videos

0 Views

10:07

Wysokorozdzielcza przyżyciowa mikroskopia pasiasta ośrodków rozrodczych

Related Videos

0 Views

06:18

Optyczne oczyszczanie i obrazowanie znakowanej immunologicznie tkanki nerki

Related Videos

0 Views

09:11

Obrazowanie nanoskopowe skrawków tkanek ludzkich poprzez ekspansję fizyczną i izotropową

Related Videos

0 Views

06:47

Poszerzanie wiedzy na temat mikrośrodowiska guza za pomocą obrazowania spektrometrią mas próbek tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie

Related Videos

0 Views

10:31

Uniwersalna retencja molekularna z 11-krotną mikroskopią ekspansywną

Related Videos

0 Views

Last updated: 18 July 2026