Aspiracja płynu z kłębuszków nerkowych myszy: metoda odsysania płynu kłębuszkowego od myszy za pomocą mikronakłucia za pośrednictwem dwóch fotonów

W nerce kłębuszek nerkowy - wiązka małych naczyń krwionośnych zamkniętych w kapsułce Bowmana - inicjuje filtrację krwi i wydala płyn odpadowy do otaczającej przestrzeni Bowmana. Badanie zawartości płynu kłębuszkowego pomaga zrozumieć fizjologię nerek.

Aby odessać płyn kłębuszkowy, przygotuj znieczuloną mysz z chirurgicznie wyeksterioryzowaną nerką. Teraz wstrzyknij barwnik fluorescencyjno-dekstranowy do naczyń krwionośnych za oczodołem oka myszy. Cząsteczki fluorescencyjnego dekstranu przemieszczają się przez krwiobieg i docierają do nerki.

Ze względu na wysoką masę cząsteczkową dekstranu barwnik fluorescencyjny zostaje zatrzymany w kłębuszku nerkowym, nadając mu zielony kolor. Pod mikroskopem dwufotonowym, który umożliwia wizualizację głęboko osadzonych struktur, zlokalizuj odpowiedni kłębuszek nerkowy, aby uzyskać odpowiedni dostęp do płynu kłębuszkowego.

Następnie wyrównaj końcówkę mikropipety pokrytą czerwonymi fluorescencyjnymi nanocząstkami z boczną osią nerki. Za pomocą mikromanipulatora przesuń końcówkę pipety, aby wniknąć w nerkę. Gdy końcówka dotrze do docelowego kłębuszka nerkowego, ustaw żądaną szybkość aspiracji, aby zassać płyn kłębuszkowy z przestrzeni Bowmana.

Brak zielonej fluorescencji wewnątrz czerwonej końcówki pipety wskazuje na brak krwawienia i potwierdza udaną aspirację płynu kłębuszkowego. Następnie należy schować pipetę i przechowywać płyn w odpowiednim buforze do dalszej analizy.

Po potwierdzeniu braku reakcji na szczypanie palców u nóg, nałóż maść na oczy i użyj taśmy, aby unieruchomić kończyny dorosłej myszy o wadze od 20 do 25 gramów. Użyj kremu do depilacji, aby usunąć wszystkie włosy po lewej stronie zwierzęcia i użyj śledziony, aby zlokalizować lewą nerkę przez skórę po grzbietowej i ogonowej stronie śledziony.

Wykonaj 0,5-centymetrowe nacięcie w skórze, a następnie mniejsze nacięcie w otrzewnej, wystarczająco duże, aby można było przepchnąć nerkę. Wyciśnij nerkę z delikatnym naciskiem i umieść wokół tkanki polisiloksanową formę stabilizującą nerki. Wyrównaj nerkę z przekładką tak, aby najbardziej boczna powierzchnia nerki wystawała poza stabilizator na około 1 milimetr i przymocuj nerkę do formy za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Przyklej płytę głowicy do formy stabilizatora i zamontuj płytę czołową do prętów montażowych na płycie podstawy.

Następnie napełnij studzienkę w podłożu polisiloksanowym 1% roztworem agarozy i przytrzymaj 10-milimetrowe szkiełko nakrywkowe na wierzchu formy, aż agaroza będzie twarda. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe do płyty głowicy za pomocą kleju i utwórz pierścień wokół szkiełka nakrywkowego za pomocą cementu dentystycznego. Następnie wstrzyknij od 100 do 150 mikrolitrów FITC-dekstranu retroorbitalnie i szybko przenieś mysz i płytkę mocującą do stolika mikroskopu dwufotonowego.

Po ręcznym ustawieniu ostrości na powierzchni nerki przełącz się na tryb dwufotonowy bez skanowania i zbadaj okno obrazowania, aby zlokalizować docelowe kłębuszki nerkowe, które znajduje się więcej niż 30 mikrometrów poniżej szkiełka nakrywkowego i mniej niż 400 mikrometrów od bocznej torebki nerkowej. Zapisać odległość poprzeczną i pionową do docelowego kłębuszka nerkowego. Następnie zapisz współrzędne stopnia x, y i z dla kłębuszków nerkowych, a na koniec podnieś ognisko obiektywu o około 1 milimetr w głąb słupa wody bez zmiany współrzędnych stopnia x i y.

Wbij końcówkę pipety do słupa wody i włącz wzbudzenie DAPI. Przesunąć pipetę w wymiarach X i Y do punktu maksymalnej fluorescencji końcówki. To będzie centrum celu. Zmień ustawienie wzbudzenia na czerwone białko fluorescencyjne i wizualizuj pipetę za pomocą okularu, aby umożliwić precyzyjne wyśrodkowanie w polu widzenia.

Przełącz się z powrotem na tryb dwufotonowy, aby znaleźć pipetę w widoku dwufotonowym na żywo i umieść końcówkę dokładnie na środku obrazu. To jest stanowisko rejestracyjne. Następnie zapisz obraz pipety i zarejestruj stopień oraz współrzędne sterownika mikropipety. Wyjmij pipetę ze słupa wody w osi x, nie przesuwając osi y i z, a następnie przesuń pipetę Z do docelowej współrzędnej Z kłębuszków nerkowych i krawędzi nerki.

Zanotuj stopień X i oblicz pipetę X na krawędzi nerki, korzystając z przesunięcia od etapu rejestracji, X. Zwiększ stopień X, aby przesunąć stolik w kierunku pipety, aż krawędź nerki znajdzie się daleko na lewo od ekranu, pozostając widoczna. Szybko przesuń pipetę na odległość około 100 mikrometrów od pipety X na krawędzi nerki, zgodnie z właśnie obliczono. Zwiększ wzmocnienie czerwieni i zacznij powoli przesuwać końcówkę pipety do krawędzi nerki w ramach obrazowania dwufotonowego na żywo, jednocześnie monitorując histogram czerwonych pikseli.

Powoli kieruj pipetę w osi x do docelowej pipety X kłębuszków nerkowych, obserwując stolik X. Po dotarciu do kłębuszków nerkowych udokumentuj pozycję za pomocą stosu Z. Trzymając pipetę na swoim miejscu, ustaw mikropompkę tak, aby wstrzykiwała 100 nanolitrów perfluorodekaliny w ciągu 2 minut, aby zapewnić drożność pipety i zmniejszyć zakłócenia spowodowane zatkaniem pipety podczas wchodzenia. Po 4 do 6 minutach filtracji ustaw mikropompę tak, aby zasysała do 300 nanolitrów z szybkością do 50 nanolitrów na minutę.