Długoterminowe ortotopowe przeszczepianie komórek nowotworowych do zarodków danio pręgowanego: skuteczna metoda dostarczania komórek nowotworowych do czwartej komory zarodków danio pręgowanego w celu długoterminowej analizy zachowania komórek nowotworowych

Podczas przeszczepu ortotopowego komórki nowotworowe lub tkanki od dawcy noszącego nowotwór są przeszczepiane do odpowiedniej tkanki biorcy tego samego gatunku. Najpierw należy przygotować jednolitą zawiesinę - w odpowiednim buforze - znakowanych fluorescencyjnie komórek guza mózgu pobranych od danio pręgowanego z nowotworem. Używając końcówki ładującej z drobnym żelem, załaduj zawiesinę komórek do igły do mikroiniekcji.

Następnie zamocuj załadowaną igłę w uchwycie mikromanipulatora. Następnie przenieś znieczulony zarodek danio pręgowanego na prefabrykowaną płytkę iniekcyjną. Aby uzyskać łatwy dostęp podczas mikroiniekcji, ustaw zarodek bokiem, aby uwidocznić komory mózgu - sieć jam wypełnionych płynem mózgowo-rdzeniowym w mózgu.

Wyreguluj końcówkę igły, aby wstrzyknąć zawiesinę komórek nowotworowych do czwartej komory, jamy w kształcie rombu tyłomózgowia zarodka. Komórki nowotworowe zajmują pustą przestrzeń w komorze. Wycofać igłę. Przenieś zarodek do naczynia hodowlanego zawierającego sól fizjologiczną. Obserwuj zarodek pod stereoskopem fluorescencyjnym, aby potwierdzić obecność komórek nowotworowych w przestrzeni komory.

Inkubuj zarodek. W ciągu kilku godzin od wstrzyknięcia komórki nowotworowe migrują i atakują otaczającą tkankę mózgową, gdzie następnie namnażają się, dając początek nowym guzom. Z biegiem czasu komórki nowotworowe namnażają się i atakują dalej, rozprzestrzeniając się po całym mózgu.

Za pomocą pipety transferowej przenieś od 10 do 20 znieczulonych zarodków na obrzeża płytki iniekcyjnej. Zarodki powinny opadać na boki, a komory powinny być dobrze widoczne i dostępne. W razie potrzeby należy użyć sondy kątowej, aby wyregulować zarodki i umieścić je z dala od zewnętrznej krawędzi płytki iniekcyjnej.

Następnie za pomocą końcówki ładującej żel załaduj od 1 do 2 mikrolitrów zawiesiny komórek nowotworowych do igły iniekcyjnej i włóż igłę do manipulatora. Następnie ręcznie opuść manipulator, trzymając igłę pod kątem 45 stopni. Wyreguluj pokrętła mikromanipulatora w kierunkach x, y i z, aż igła znajdzie się tuż nad i około 5 milimetrów po prawej stronie głowy zarodka.

Za pomocą mikroskopu stereoskopowego powoli ustaw mikromanipulator w kierunku x, aż igła przebije czwartą komorę zarodka. Nie pozwól, aby igła przebiła serce lub żółtko. W celu konsekwentnego wstrzykiwania zarodki muszą być znieczulone. Guz musi być prawidłowo zdysocjowany do zawiesiny komórkowej, a igła musi przebić czwartą komorę, ale nie może wychodzić poza serce.

Naciśnij pedał nożny mikrowstrzykiwacza, aby wstrzyknąć zawiesinę komórek nowotworowych. Po zakończeniu wstrzykiwania należy użyć świeżej wody z jaja, aby delikatnie spłukać wstrzyknięte zarodki z płytki iniekcyjnej na szalkę Petriego. Teraz zbadaj wstrzyknięte zarodki pod stereoskopowym mikroskopem fluorescencyjnym w ciemnym pokoju. Upewnij się, że ciśnienie iniekcji, kąt, rozmiar igły i lepkość zawiesiny komórek powodują, że komórki nowotworowe wypełniają od 25% do 50% przestrzeni komory.

Umieść zarodki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 28 stopni Celsjusza na noc. Następnego dnia oceń przeżywalność zarodka, badając cechy morfologiczne i fizjologiczne, takie jak prawidłowy rozwój serca i mózgu, jak opisano wcześniej.