JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologia
0 wyświetleń • 3:38 min • July 8th, 2025
Grzbietowa powierzchnia języka myszy pokryta jest trzema głównymi rodzajami wypukłych wypukłości zwanych brodawkami, a mianowicie brodawkami grzybowymi, obwodowymi i nitkowatymi. Brodawki obwodowe lub CVP, składające się z rowów nabłonkowych, w których znajdują się kubki smakowe, są podtrzymywane przez warstwę tkanki łącznej - blaszkę właściwą.
Aby wyizolować nabłonek CVP, zacznij od uśpionej myszy w pozycji leżącej. Następnie naciąć policzki i wypreparować gruby pas tkanki - wędzidełko językowe - aby oddzielić język od dna jamy ustnej. Przenieść wycięty język do naczynia zawierającego schłodzony bufor.
Następnie wytnij przednią część języka. Ostrożnie wstrzyknąć koktajl trawienny zawierający enzymy dyspazy i kolagenazy do przestrzeni podnabłonkowej regionu CVP, między nabłonkiem a tkankami leżącymi poniżej. Wycofać igłę, jednocześnie wstrzykując zawiesinę w to miejsce.
Inkubuj język przez odpowiedni czas. Dypazy i kolagenazy trawią białka macierzy zewnątrzkomórkowej w tkance łącznej, ułatwiając oddzielenie nabłonka CVP od tkanki. Po inkubacji wykonaj nacięcia w nabłonku w okolicy CVP.
Delikatnie oddziel rozluźniony nabłonek od znajdującej się pod nim tkanki. Na koniec przenieś oddzielony nabłonek CVP do rurki pokrytej białkiem, aby zapobiec przywieraniu tkanki do ścianki rurki. Nabłonek CVP może być przechowywany w celu dalszego przetwarzania.
Po eutanazji dorosłej myszy użyj dużych sterylnych nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć policzki i złamać szczękę. Następnie podnieś język i przetnij wędzidełko językowe, aby oddzielić język od dna jamy ustnej. Wytnij język i zbierz go w sterylnym, lodowatym dPBS z wapniem i magnezem.
Pod mikroskopem preparacyjnym usuń i wyrzuć przedni język, przecinając żyletką tylko przednią część wyniosłości międzytrzonowej. Następnie za pomocą delikatnej chusteczki do usuwania włosów i nadmiaru płynu z tylnego języka.
Następnie napełnij 1-mililitrową strzykawkę 200 do 300 mikrolitrami roztworu enzymu do wstrzykiwań i włóż igłę o rozmiarze 30 i średnicy 1/2 cala tuż nad wyniosłością międzytrzonową, aż do wnętrza brodawek okołotrzowych lub CVP. Wstrzyknąć roztwór enzymu pod i na bocznych krawędziach CVP między nabłonkiem a znajdującymi się pod nim tkankami. Powoli i w sposób ciągły wyjmować strzykawkę z języka podczas wstrzykiwania roztworu.
Inkubować język w sterylnym PBS bez wapnia/magnezu w temperaturze pokojowej dokładnie przez 33 minuty. Używając bardzo drobnych nożyczek preparacyjnych, wykonaj małe nacięcia w nabłonku obustronnie i tuż przed CVP. Następnie delikatnie obierz nabłonek, unosząc go drobnymi kleszkami. Gdy nabłonek rowu zostanie wolny od leżącej pod spodem tkanki łącznej, umieść go w 2-mililitrowej probówce do mikrowirówki wstępnie pokrytej FBS.