Obrazowanie przyżyciowe: metoda obserwacji trzustki myszy na poziomie komórkowym przez ustabilizowane okno obrazowania

Obrazowanie przyżyciowe polega na wizualizacji komórek żywego zwierzęcia przez okienko obrazowania wszczepione zwierzęciu. Umożliwia długotrwałą obserwację dynamiki komórek bez uszczerbku dla ich funkcji.

Na początek weźmy znieczuloną transgeniczną mysz, której wcześniej wszczepiono okienko obrazowania trzustki wsparte na metalowej płytce. Płytka podstawy przestrzennie oddziela trzustkę od jelit, redukując w ten sposób artefakty ruchowe wynikające z ruchów fizjologicznych, takich jak perystaltyka.

Transgeniczna mysz wykazuje ekspresję białka zielonej fluorescencji lub GFP pod promotorem genu insuliny ulegającym ekspresji w komórkach beta wysp trzustkowych.

Następnie mocno chwyć ogon myszy i spryskaj go środkiem dezynfekującym, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia powierzchniowe. Wprowadzić cewnik do żyły ogonowej bocznej. Wstrzyknąć roztwór zawierający przeciwciała oznaczone czerwoną sondą fluorescencyjną do żyły ogonowej. Przeciwciała te wiążą się z komórkami wyściełającymi naczynia krwionośne, barwiąc je na czerwono.

Teraz przesuń mysz do konfiguracji mikroskopii przyżyciowej. Włóż okienko do obrazowania trzustki do uchwytu okienka. Rozpocznij obrazowanie w małym powiększeniu, aby zlokalizować zielone fluorescencyjne skupiska wysp otoczone czerwonymi fluorescencyjnymi naczyniami krwionośnymi. Zwiększ powiększenie, aby uzyskać wysokiej jakości obrazowanie na poziomie komórkowym poszczególnych komórek beta.

Zacznij od włączenia mikroskopu przyżyciowego, w tym mocy lasera. Aby wprowadzić cewnik naczyniowy, należy uciskać palcem wskazującym i trzecim palcem na bliższą stronę ogona. W razie potrzeby podgrzej ogon lampą. Zdezynfekuj żyłę ogonową za pomocą sprayu z 70% etanolem, a następnie wprowadź cewnik o rozmiarze 30 do bocznej żyły ogonowej i uwidocznij niedomykalność krwi w probówce PE-10. Nałóż jedwabną taśmę na cewnik, aby go ustabilizować.

Wstrzyknąć dekstran FITC i dekstran TMR lub inne sondy fluorescencyjne, w zależności od przypadku, w zależności od kombinacji sond fluorescencyjnych. Włóż sondę doodbytniczą, aby automatycznie kontrolować temperaturę ciała za pomocą homeotermicznego systemu poduszek grzewczych. Następnie należy włożyć okienko do obrazowania trzustki przygotowane podczas ustawiania mikroskopii przyżyciowej do uchwytu okienka. Przenieś mysz z platformy chirurgicznej na etap obrazowania.

Aby wykonać obrazowanie przyżyciowe, zacznij od obrazowania trzustki w małym powiększeniu, na przykład czterokrotnie, aby zeskanować cały widok trzustki w okienku obrazowania trzustki. Po określeniu obszaru zainteresowania przełącz się na soczewkę obiektywową o większym powiększeniu, na przykład 20 lub 40 razy, aby wykonać obrazowanie na poziomie komórkowym z rozdzielczością boczną i osiową odpowiednio około 0,5 mikrometra i 3 mikrometrów.

Wykonaj obrazowanie z-stack lub poklatkowe, aby obserwować strukturę 3D lub dynamikę na poziomie komórkowym, taką jak migracja komórek.