Generowanie mysiego modelu pętli proksymalnej jelita grubego: procedura chirurgiczna mająca na celu wygenerowanie pętli proksymalnej jelita grubego i pomiar przepuszczalności jelit poprzez wykrycie markerów fluorescencyjnych w surowicy po wstrzyknięciu doświetlnym

W stanach patologicznych upośledzona bariera połączeń ścisłych nabłonka jelitowego powoduje zwiększone przenikanie szkodliwej zawartości światła do krążenia ogólnoustrojowego, co skutkuje nasileniem ogólnoustrojowego stanu zapalnego.

Aby ocenić przepuszczalność jelit poprzez wygenerowanie pętli proksymalnej jelita grubego lub modelu pcLoop, przygotuj znieczuloną mysz w pozycji leżącej. Wykonaj nacięcie brzucha w linii środkowej. Delikatnie zewnętrzizuj jelito ślepe, końcowe jelito kręte i proksymalną okrężnicę, umieszczając na mokrej gazie, aby utrzymać nawodnienie narządów.

Zlokalizuj mezookrężnicę bliższej okrężnicy — błoniaste fałdy otrzewnej zawierające naczynia krwionośne. Zidentyfikuj dwa odpowiednio oddalone od siebie miejsca w mezookrężnicy wolne od naczyń krwionośnych, dystalne od jelita ślepego, które mają być podwiązane. Wykonaj perforację witryn.

Tworząc ligaturę w wybranych miejscach, wykonaj nacięcia blisko podwiązanych miejsc, aby wyizolować segment pcLoop bez naruszania dopływu krwi. Przepłucz segment buforem, aby usunąć wszelkie fekalia.

Chirurgicznie zwiąż odcięte końce zapłukanego segmentu. Wstrzyknąć żądany roztwór markera fluorescencyjnego do światła odcinka okrężnicy. Zwróć narządy do jamy brzusznej. Zamknij nacięcie chirurgiczne i pozwól myszy dojść do siebie.

Po wstrzyknięciu zmniejszona integralność bariery jelitowej ułatwia zwiększony transport parakomórkowy cząsteczek markerów fluorescencyjnych ze światła jelita do krążenia krwi, które można wykryć we frakcji surowicy krwi w celu zmierzenia przepuszczalności jelit.

Przygotuj mysz do operacji i zewnętrznij kątnicę. Za pomocą mokrych bawełnianych wacików zewnętrznij całe jelito kręte i umieść je na mokrej bawełnianej gazie. Zidentyfikuj proksymalną okrężnicę do dopływu krwi znajdującego się w mezookrężnicy. Zmobilizuj proksymalną okrężnicę i utwórz pierwszą ligaturę w obszarze wolnym od naczyń w mezocolon, około 0,5 centymetra dystalnie od kątnicy.

Zmierz 2 centymetry od pierwszej ligatury i utwórz drugą ligaturę w obszarze wolnym od dopływu krwi w mezokrę. Za pomocą cienkich nożyczek ostrożnie przetnij obok każdego podwiązania, aby wyizolować pętlę pcLoop o długości 2 centymetrów.

Delikatnie przepłucz pcLoop ciepłym HBSS, aby usunąć kał za pomocą elastycznej żółtej rurki do karmienia dołączonej do 10-mililitrowej strzykawki. Upewnij się, że zawartość światła została wypłukana z jamy brzusznej, aby utrzymać miejsce operacji w czystości. Następnie podwiąż dwa odcięte końce spłukiwanej pętli pcLoop za pomocą jedwabnego szwu.

Użyj 1-mililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 30, aby powoli wstrzyknąć 200 mikrolitrów odczynnika, takiego jak FITC-dextrans lub chemokina, do światła jelita. pcLoop napompuje się, powodując umiarkowane rozdęcie błony śluzowej. Użyj mokrych bawełnianych wacików, aby delikatnie włożyć z powrotem podwiązaną pętlę pcLoop, jelito kręte i kątnicę. Zamknij ścianę brzucha za pomocą uchwytu na igłę, anatomicznych kleszczyków i niewchłanialnych szwów jedwabnych 3,0 z igłą do odwrotnego cięcia.