Izolowanie komórek IPE i RPE: technika pozyskiwania komórek nabłonka pigmentowego oka z oka królika

Komórki nabłonka barwnikowego to końcowo zróżnicowane komórki prostopadłościenne połączone ścisłymi połączeniami. Te komórki nabłonkowe wyściełające tęczówkę są komórkami nabłonka barwnika tęczówki lub komórkami IPE, a te w pobliżu siatkówki to komórki nabłonka barwnikowego siatkówki lub komórki RPE.

Aby wyodrębnić te komórki, weź nienaruszone oko królika. Potraktuj oko środkiem dezynfekującym, aby usunąć wszelkie mikroorganizmy z powierzchni oka. Zmyj środek dezynfekujący roztworem buforowym. Wykonaj nacięcie w pobliżu tęczówki. Korzystając z tego otworu, wykonaj pełne okrągłe cięcie wzdłuż granicy tęczówki, dzieląc oko na przedni segment zawierający tęczówkę i tylną część zawierającą siatkówkę i ciało szkliste.

Weź przedni odcinek i wyrzuć soczewkę, aby uzyskać dostęp do tęczówki. Usuń tęczówkę i umieść ją na naczyniu hodowlanym. Następnie weź tylny segment i wyrzuć galaretowaty płyn ciała szklistego i siatkówkę z bańki oka.

Potraktuj tęczówkę i bańkę oka trypsyną i inkubuj. Trypsyna degraduje białka połączenia ścisłego i macierzy zewnątrzkomórkowej, inicjując dysocjację komórek nabłonkowych. Wyrzuć trypsynę i dodaj odpowiednią pożywkę hodowlaną. Delikatnie zeskrob powierzchnię tęczówki i bańki oka, aby uwolnić komórki nabłonka z podłoża.

Na koniec wysiewaj komórki IPE i RPE w oddzielnych studzienkach. Komórki są gotowe do dalszych testów.

Po eutanazji zwierzęcia użyj zakrzywionych nożyczek i kleszczy Colibri, aby wyłuszczyć oczy, a następnie oczyść pozostałą tkankę mięśniową i skórę z oczu. Zbierz oczy do 50-mililitrowej probówki wypełnionej niesterylnym PBS i przenieś probówkę do okapu z przepływem laminarnym. Zdezynfekuj je, zanurzając je w roztworze na bazie jodu na dwie minuty, a następnie przenieś oczy do 50-mililitrowej probówki wypełnionej sterylnym PBS.

Połóż jedno oko na sterylnym kompresie z gazy i mocno przytrzymaj oko blisko nerwu wzrokowego, a następnie przetnij w pobliżu granicy tęczówki skalpelem #11. Za pomocą nożyczek przetnij wokół tęczówki i usuń przedni segment, a następnie umieść go na szalce Petriego, pozostawiając bańkę z ciałem szklistym, aż do wyizolowania nabłonka barwnikowego siatkówki lub komórek RPE.

Aby wyizolować nabłonek pigmentowy tęczówki lub komórki IPE, usuń soczewkę cienkimi kleszkami i delikatnie wyciągnij tęczówkę zawierającą komórki IPE. Umieść tęczówkę na szalce Petriego i umyj ją sterylnym PBS. Dodaj 500 mikrolitrów 0,25% trypsyny i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usuń trypsynę, dodaj 500 mikrolitrów kompletnego podłoża i delikatnie zeskrob IPE płaską, wypolerowaną pipetą Pasteura.

Zbierz zawiesinę komórek i umieść ją w 1,5-mililitrowej probówce. Policz komórki za pomocą komory Neubauera i zasiej 0,2 miliona komórek na dołek na 24-dołkowej płytce z 1 mililitrem kompletnego podłoża. Umieść płytkę w inkubatorze i hoduj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Aby wyizolować komórki RPE, usuń ciało szkliste i siatkówkę z tylnego segmentu za pomocą cienkich kleszczy. Umieść cebulki w 24-dołkowej płytce i dodaj 500 mikrolitrów 0,25% trypsyny na oko i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usuń trypsynę, dodaj 500 mikrolitrów kompletnej pożywki na kulę ziemską i delikatnie zeskrob komórki RPE zakrzywioną, polerowaną ogniowo pipetą Pasteura.

Zbierz zawiesinę komórek i umieść ją w 1,5-mililitrowej probówce. Policz komórki za pomocą komory Neubauera i zasiej komórki zgodnie z wcześniejszym opisem. Umieścić płytkę w inkubatorze.