JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologia
0 wyświetleń • 4:17 min • July 8th, 2025
Komórki nabłonka barwnikowego to końcowo zróżnicowane komórki prostopadłościenne połączone ścisłymi połączeniami. Te komórki nabłonkowe wyściełające tęczówkę są komórkami nabłonka barwnika tęczówki lub komórkami IPE, a te w pobliżu siatkówki to komórki nabłonka barwnikowego siatkówki lub komórki RPE.
Aby wyodrębnić te komórki, weź nienaruszone oko królika. Potraktuj oko środkiem dezynfekującym, aby usunąć wszelkie mikroorganizmy z powierzchni oka. Zmyj środek dezynfekujący roztworem buforowym. Wykonaj nacięcie w pobliżu tęczówki. Korzystając z tego otworu, wykonaj pełne okrągłe cięcie wzdłuż granicy tęczówki, dzieląc oko na przedni segment zawierający tęczówkę i tylną część zawierającą siatkówkę i ciało szkliste.
Weź przedni odcinek i wyrzuć soczewkę, aby uzyskać dostęp do tęczówki. Usuń tęczówkę i umieść ją na naczyniu hodowlanym. Następnie weź tylny segment i wyrzuć galaretowaty płyn ciała szklistego i siatkówkę z bańki oka.
Potraktuj tęczówkę i bańkę oka trypsyną i inkubuj. Trypsyna degraduje białka połączenia ścisłego i macierzy zewnątrzkomórkowej, inicjując dysocjację komórek nabłonkowych. Wyrzuć trypsynę i dodaj odpowiednią pożywkę hodowlaną. Delikatnie zeskrob powierzchnię tęczówki i bańki oka, aby uwolnić komórki nabłonka z podłoża.
Na koniec wysiewaj komórki IPE i RPE w oddzielnych studzienkach. Komórki są gotowe do dalszych testów.
Po eutanazji zwierzęcia użyj zakrzywionych nożyczek i kleszczy Colibri, aby wyłuszczyć oczy, a następnie oczyść pozostałą tkankę mięśniową i skórę z oczu. Zbierz oczy do 50-mililitrowej probówki wypełnionej niesterylnym PBS i przenieś probówkę do okapu z przepływem laminarnym. Zdezynfekuj je, zanurzając je w roztworze na bazie jodu na dwie minuty, a następnie przenieś oczy do 50-mililitrowej probówki wypełnionej sterylnym PBS.
Połóż jedno oko na sterylnym kompresie z gazy i mocno przytrzymaj oko blisko nerwu wzrokowego, a następnie przetnij w pobliżu granicy tęczówki skalpelem #11. Za pomocą nożyczek przetnij wokół tęczówki i usuń przedni segment, a następnie umieść go na szalce Petriego, pozostawiając bańkę z ciałem szklistym, aż do wyizolowania nabłonka barwnikowego siatkówki lub komórek RPE.
Aby wyizolować nabłonek pigmentowy tęczówki lub komórki IPE, usuń soczewkę cienkimi kleszkami i delikatnie wyciągnij tęczówkę zawierającą komórki IPE. Umieść tęczówkę na szalce Petriego i umyj ją sterylnym PBS. Dodaj 500 mikrolitrów 0,25% trypsyny i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usuń trypsynę, dodaj 500 mikrolitrów kompletnego podłoża i delikatnie zeskrob IPE płaską, wypolerowaną pipetą Pasteura.
Zbierz zawiesinę komórek i umieść ją w 1,5-mililitrowej probówce. Policz komórki za pomocą komory Neubauera i zasiej 0,2 miliona komórek na dołek na 24-dołkowej płytce z 1 mililitrem kompletnego podłoża. Umieść płytkę w inkubatorze i hoduj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
Aby wyizolować komórki RPE, usuń ciało szkliste i siatkówkę z tylnego segmentu za pomocą cienkich kleszczy. Umieść cebulki w 24-dołkowej płytce i dodaj 500 mikrolitrów 0,25% trypsyny na oko i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usuń trypsynę, dodaj 500 mikrolitrów kompletnej pożywki na kulę ziemską i delikatnie zeskrob komórki RPE zakrzywioną, polerowaną ogniowo pipetą Pasteura.
Zbierz zawiesinę komórek i umieść ją w 1,5-mililitrowej probówce. Policz komórki za pomocą komory Neubauera i zasiej komórki zgodnie z wcześniejszym opisem. Umieścić płytkę w inkubatorze.
Niniejszy artykuł opisuje izolację komórek nabłonka pigmentowego tęczówki (IPE) oraz nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE) z oczu królika. Proces obejmuje staranną dyssekcję oraz obróbkę enzymatyczną w celu dysocjacji komórek do dalszych analiz.
Izolacja komórek nabłonka pigmentowego oka umożliwia mechanistyczną minimalizację ryzyka w procesie walidacji celów terapeutycznych w chorobach siatkówki, dostarczając system istotny dla danej jednostki chorobowej do przeprowadzenia analiz funkcjonalnych. Technika ta wspiera opracowywanie testów oraz screening fenotypowy strategii terapeutycznych ukierunkowanych na zwyrodnieniowe choroby siatkówki. Metoda ta zwiększa pewność predykcyjną w modelach przedklinicznych poprzez dostarczenie pierwotnych komórek przypominających ludzkie do badań nad oddziakiwaniem z celem terapeutycznym.
Metoda ta integruje się z kontinuum procesów odkrywania leków, od walidacji celu po badania przedkliniczne, dostarczając pierwotnych komórek nabłonka oka do analiz mechanistycznych i fenotypowych.
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ostatnia aktualizacja: 29 sierpnia 2026