JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Biologia
0 wyświetleń • 4:35 min. • July 8th, 2025
Oskrzeliki to kanalikowe drogi oddechowe płuc. Podczas przewlekłej infekcji oskrzeliki zatykają się z powodu gromadzenia się śluzu. Bogaty w składniki odżywcze śluz zapewnia odpowiednie środowisko do rozwoju bakterii oportunistycznych. Bakterie te osadzają się w samodzielnie wytworzonej zewnątrzkomórkowej matrycy polimerowej i namnażają się, tworząc biofilm.
Aby naśladować rozwój biofilmu bakteryjnego w płucach, należy pobrać próbkę tkanki oskrzelików świni na szalce Petriego. Rozetnij tkankę na kawałki o pożądanym kształcie. Dodać pożywkę do hodowli biofilmu na szalkę Petriego. Wysterylizuj naczynie w świetle UV, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia powierzchniowe.
Przenieś wysterylizowane fragmenty tkanek na wielodołkową płytkę zawierającą pożywkę do hodowli biofilmu i podkładki agarozowe, które służą jako optymalne podłoże do adhezji bakterii. Następnie nakłuj końcówkę igły zawierającą kolonię pożądanych bakterii na każdym kawałku tkanki, aby wprowadzić bakterie planktonowe do tkanki. Uszczelnij płytkę za pomocą wysterylizowanej promieniami UV, porowatej membrany, która ułatwia równomierną wymianę tlenu na całej powierzchni płytki. Inkubować zamkniętą płytkę.
Podczas inkubacji bakterie nieodwracalnie przylegają do powierzchni nabłonka przez pilusy i zaczynają wydzielać macierz zewnątrzkomórkową. W matrycy bakterie wykorzystują źródła energii, mucynę i wolne DNA z pożywki hodowlanej do tworzenia biofilmów. Model biofilmu bakteryjnego jest gotowy do dalszych badań.
Umieść oskrzelik w pierwszym płukaniu DMEM/RPMI 1640. Pozostaw go w praniu i zbierz dodatkowe skrawki oskrzelików z tego samego płuca, aby uzyskać wystarczającą ilość skrawków tkanki do planowanego eksperymentu. Umieść wszelkie dodatkowe skrawki oskrzelików z tego samego płuca w płynie do płukania i pozostaw je w płuczce na co najmniej dwie minuty.
Usunąć oskrzeliki z pierwszego płukania i umieścić próbki na sterylnej szalce Petriego. Lekko trzymaj każde oskrzelik sterylnymi kleszkami, uważając, aby nie uszkodzić tkanki. Usuń jak najwięcej pozostałej tkanki miękkiej i pokrój tkankę na paski o szerokości pięciu milimetrów za pomocą sterylnych nożyczek do preparowania.
Umieść wszystkie paski tkanki oskrzelowej w drugim płukaniu DMEM/RPMI 1640. Pozostaw je w praniu na co najmniej dwie minuty. Następnie usuń paski tkanek z drugiego płukania za pomocą sterylnych kleszczy i umieść je na czystej, sterylnej szalce Petriego. Usuń pozostałą tkankę miękką przyczepioną do oskrzelików i pokrój paski na kwadraty za pomocą sterylnych nożyczek do rozwarstwiania.
Dodaj trzeci płyn do płukania DMEM/RPMI 1640 na szalkę Petriego i delikatnie wymieszaj kawałki chusteczki w praniu, obracając naczynie. Wylej trzecie płukanie z szalki Petriego, nie usuwając kawałków tkanki.
Następnie dodaj ostatnie płukanie SCFM, upewniając się, że wszystkie kawałki chusteczki są pokryte. Sterylizuj tkankę w SCFM w świetle UV przez pięć minut. Za pomocą sterylnych kleszczyków przenieś każdy wysterylizowany fragment tkanki oskrzelikowej do indywidualnych dołków 24-dołkowej płytki zawierającej płatki agarozowe SCFM.
Aby zainfekować każdy fragment tkanki pożądanym szczepem bakteryjnym, dotknij kolonii wyhodowanej na płytce agarowej końcówką igły o rozmiarze 29 przymocowanej do sterylnej strzykawki insulinowej o pojemności 0,5 mililitra. Następnie dotknij kolonii na kawałku tkanki, delikatnie nakłuwając powierzchnię. W przypadku niezakażonych grup kontrolnych delikatnie nakłuć powierzchnię kawałka tkanki końcówką igły.
Następnie za pomocą pipety dodaj 500 mikrolitrów SCFM do każdej studzienki. Sterylizuj oddychającą membranę uszczelniającą dla każdej 24-dołkowej płytki w świetle ultrafioletowym przez 10 minut. Zdejmij pokrywkę z płytki 24-dołkowej i zastąp ją oddychającą membraną. Następnie inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez wstrząsania.