JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Biologia
0 wyświetleń • 3:02 min. • July 8th, 2025
Oocyt świni otoczony jest zwartym, wielowarstwowym skupiskiem komórek wzgórka tworzących kompleks wzgórko-oocyt lub COC. Najbardziej wewnętrzne komórki wzgórka rozszerzają procesy przez osłonkę przejrzystą oocytu. W procesach tych rozwijają się zarówno połączenia szczelinowe, jak i pośrednie, które pomagają w międzykomórkowym przenoszeniu cząsteczek między oocytem a otaczającymi komórkami wzgórka. Te dwukierunkowe interakcje utrzymują żywotność COC, co jest kluczowym wyznacznikiem udanego zapłodnienia in vitro lub IVF.
Aby wyizolować COC, zanurz kilka pęcherzyków jajnikowych świń na szalce Petriego zawierającej pożywkę dojrzewającą. Pożywka ta zawiera hormony niezbędne do dojrzewania oocytów in vitro. Wypreparuj pęcherzyki jajnikowe, aby uwolnić COC i płyn pęcherzykowy na szalkę Petriego. Płyn ten uzupełnia pożywkę dojrzewającą w dodatkowe składniki odżywcze i hormony niezbędne dla kompetencji oocytów.
Odessać uwolnioną zawartość pęcherzyków i przenieść ją na inną szalkę Petriego. Wizualizuj płytkę pod mikroskopem, aby zidentyfikować nieuszkodzone COC, które wykazują normalną morfologię, składające się z okrągłych oocytów z umiarkowanie ziarnistą cytoplazmą i nienaruszonym ciałem polarnym otoczonym komórkami wzgórka.
Wyizolować pojedynczy COC i przenieść go do centralnej studzienki płytki IVF zawierającej pożywkę do dojrzewania. Przechowuj płytkę w optymalnej temperaturze do czasu dalszego użycia.
Aby wyizolować COC ze średniej wielkości pęcherzyków, przenieś dwa do trzech jajników na sterylną 10-centymetrową szalkę Petriego wypełnioną HM. Delikatnie przetnij powierzchnię wystających pęcherzyków jajnikowych sterylnym ostrzem chirurgicznym #15, co spowoduje, że płyn pęcherzykowy, a COC wypłyną na szalkę Petriego. Odessać zawartość pęcherzyków za pomocą igły o rozmiarze 28 dołączonej do jednorazowej strzykawki i przenieść ją na inną szalkę Petriego.
Aby przygotować szalki Petriego do zapłodnienia in vitro, dodaj 1 mililitr HM do centralnych dołków i umieść trzy do czterech kropli HM w zewnętrznych pierścieniach. Następnie za pomocą mikropipety z poliwęglanu przesuń nieuszkodzone COC do kropli HM w pierścieniach zewnętrznych i krótko je przepłucz trzy do czterech razy. Po zakończeniu przenieś je indywidualnie do centralnej studni. Przechowywać płytki IVF w inkubatorze.