JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologia
0 wyświetleń • 3:29 min • July 8th, 2025
Przygotuj złoże z fluorowanego etylenu propylenu lub FEP w naczyniu hodowlanym. Dodać kroplę pożywki do dojrzewania zawierającej kompleksy wzgórko-oocytów lub COC do proszku FEP. Delikatnie przetocz kroplę na proszek, aby uformować płynną kulkę lub LM. Proszek FEP tworzy hydrofobową porowatą powłokę, umożliwiając wymianę gazową między cieczą wewnętrzną a otaczającym środowiskiem.
Teraz zbierz jednostkę LM i przenieś ją do centralnej studzienki płytki Petriego do zapłodnienia in vitro. Dodaj sterylną wodę do zewnętrznego pierścienia, aby utrzymać nawodnienie COC. Następnie inkubuj LM w warunkach fizjologicznych, aby umożliwić dojrzewanie oocytów.
Następnie usuń zużyte podłoże i dodaj świeże podłoże do dojrzewania. Bezpośredni kontakt z cieczą przerywa hydrofobową powłokę FEP i rozbija LM w celu uwolnienia COC. Przenieś uwolnione COC do nowego naczynia zawierającego świeżą kroplę pożywki dojrzewającej i umyj je w celu usunięcia cząstek FEP.
Po umyciu przenieś COC i świeże podłoże na złoże proszkowe FEP. Zwiń kroplę, aby pokryć ją proszkiem. Na koniec przenieś LM na szalkę Petriego do zapłodnienia in vitro. Powlekane proszkowo LM FEP utrzymują strukturę 3D oocytów i zwiększają ich żywotność.
Przygotuj podłoże z 5 gramów proszku FEP na 30-milimetrowej szalce Petriego. Rozprowadzić pojedynczą kroplę pożywki dojrzewającej, zawierającą od 3 do 5 COC, na proszek FEP. Delikatnie obracaj płytkę ruchem okrężnym, aby upewnić się, że cząsteczki całkowicie pokrywają powierzchnię kropli cieczy i tworzą płynne kulki lub LM.
Przygotuj kilka 60-milimetrowych szalek Petriego do zapłodnienia in vitro i dodaj od 3 do 4 mililitrów sterylnej wody do zewnętrznych pierścieni, aby utworzyć komorę wilgotnościową. Podnieś uformowany LM za pomocą pipety o pojemności 1,000 mikrolitrów i umieść go w studzience centralnej. Inkubuj kulki przez cztery dni w temperaturze 38 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla.
Aby zmienić pożywkę, nałóż 30 mikrolitrów pożywki dojrzewającej na każdy LM, co spowoduje jego rozprzestrzenianie się. Gdy zawartość marmuru się rozpuści, przenieś COC uwolnione z bioreaktora do kropli świeżej pożywki dojrzewającej na szalce Petriego. Po 3 do 4 praniach w pożywce do dojrzewania przenieś COC wraz z 30 mikrolitrami świeżej pożywki na złoże proszkowe FEP.
Delikatnie obracaj płytkę ruchem okrężnym, aby upewnić się, że cząsteczki proszku całkowicie pokrywają powierzchnię kropli cieczy i tworzą nowy LM. Następnie przenieś LM na szalkę Petriego do zapłodnienia in vitro.